實(shí)驗(yàn)方法原理    將抗Tac特異性單克隆抗體Ab1吸附于固相載體，識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)上清或血清等標(biāo)本中Tac并與之結(jié)合。應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別另一種Tac表位的特異性單克隆抗體Ab2識(shí)別固定于固相載體的Tac并與之結(jié)合。通過(guò)酶催化底物顯色反映待檢標(biāo)本中游離Tac的水平。
實(shí)驗(yàn)材料    抗體PHA
試劑、試劑盒    緩沖液洗滌液稀釋液終止液
儀器、耗材    塑料板檢測(cè)儀水浴箱冰箱CO2孵箱加樣器
實(shí)驗(yàn)步驟    
1.  刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

取外周血10 ml，肝素抗凝，常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，加至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×106 /孔，RPMI1640-10％ FCS＋PHA 3 μg/ml，Wellcome公司，37 ℃、5 ％CO2培養(yǎng)72 小時(shí)，收集上清，-20 ℃保存待測(cè)。同時(shí)設(shè)未加PHA對(duì)照組。可選用病人血清為待測(cè)標(biāo)本。

2.  Ab1包被

用0.05 M pH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗Tac特異性單克隆抗體（Ab1）稀釋 至5 μg/ml，加至ELISA板，100 μl/孔，4 ℃包被72 小時(shí)。

3.  封閉

1 ％BSA-PBS封閉，350 μl/孔，37 ℃孵育2小時(shí)。

4.  加樣

ELISA板用PBS-T洗液洗3次，PHA刺激單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照 組上清或病人血清倍比稀釋至1∶1024，每一稀釋度取100 μl加至ELISA板。HUT- 102B2細(xì)胞培養(yǎng)上清為陽(yáng)性對(duì)照，RPMI1640-10％FCS培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。37 ℃，孵育 2 小時(shí)，洗滌。

5.  加酶標(biāo)抗體

于各反應(yīng)孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記另一種抗 Tac 特異性單克隆 抗體Ab2以效價(jià)滴定的*稀釋度稀釋100 μl。37 ℃孵育2小時(shí)，洗滌。

6.  加底物顯色

各反應(yīng)孔加新鮮配制ABTS底物溶液100 μl，37 ℃，孵育15 分 鐘。

7.  終止反應(yīng)

各反應(yīng)孔加2 ％氟化鈉終止液50 μl。

8.  結(jié)果判定

首先肉眼觀(guān)察反應(yīng)孔內(nèi)顏色，稀釋梯度是否均勻。陽(yáng)性、u性結(jié) 果是否明顯。然后于ELISA檢測(cè)儀上測(cè)各孔OD值（410 nm）。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  包被抗體活性要較高，否則影響本實(shí)驗(yàn)敏感性。

2.  經(jīng)篩選比較，封閉液以1 ％BSA-PBS為好。

3.  酶標(biāo)結(jié)合物應(yīng)用前應(yīng)進(jìn)行效價(jià)滴定，選擇*工作濃度。

4.  底物應(yīng)選用靈敏度較高的供氫體如ABTS等。

5.  如有條件，酶標(biāo)McAb可由生物素-McAb和親和素-HRP系統(tǒng)代替，以增加實(shí) 驗(yàn)的敏感性。