細(xì)胞一般在凍存及復(fù)蘇的時(shí)候，很多客戶(hù)因?yàn)椴僮鞑划?dāng)，比如溫度、保護(hù)劑、時(shí)間等沒(méi)控制好，導(dǎo)致凍存及復(fù)蘇細(xì)胞的時(shí)候，細(xì)胞容易出現(xiàn)活性差、狀態(tài)不好等情況，其實(shí)細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”，這樣可以zui大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性；緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

這次淺談一下細(xì)胞凍存的具體操作步驟及要點(diǎn)：

細(xì)胞凍存操作要點(diǎn)：

1、細(xì)胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2、待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細(xì)胞則直接離心。

3、棄上清，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10⁶~1×10⁷cells/mL。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期等。（細(xì)胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件調(diào)整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一個(gè)晚上→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一個(gè)晚上，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線(xiàn)；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

5、細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，技術(shù)細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存，為穩(wěn)妥起見(jiàn)可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，再繼續(xù)凍存。