細胞一般在凍存及復(fù)蘇的時候,很多客戶因為操作不當(dāng),比如溫度、保護劑、時間等沒控制好,導(dǎo)致凍存及復(fù)蘇細胞的時候,細胞容易出現(xiàn)活性差、狀態(tài)不好等情況,其實細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是“慢凍快融”,這樣可以zui大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜(DMSO)作為保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性;緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復(fù)蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
這次淺談一下細胞凍存的具體操作步驟及要點:
細胞凍存操作要點:
1、細胞凍存前12~24h,換新鮮培養(yǎng)基,使細胞一直處于對數(shù)生長期。
2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化,用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液,1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。
3、棄上清,加入凍存液重懸細胞沉淀,調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內(nèi),每管1~1.5mL,擰緊蓋子。在管壁上做好標記,標明細胞名稱、凍存日期等。(細胞凍存液配方可為胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=4:6:1或胎牛血清:培養(yǎng)基:DMSO=1:9:1或胎牛血清:DMSO=9:1,可根據(jù)各實驗室實際條件調(diào)整)
4、按下列順序依次降溫:室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一個晚上→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便,細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一個晚上,再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線;凍存5次后異丙醇需要跟換一次,以免影響凍存效果。
5、細胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,技術(shù)細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存,為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),觀察細胞生長情況,再繼續(xù)凍存。
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