實驗方法原理    先用組織學(xué)完整的新鮮人肝癌組織接種于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤組織再接種于裸鼠肝內(nèi)，建立肝原位移植瘤模型（間接肝原位移植瘤模型），并將其與直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔內(nèi)移植瘤模型作比較。
實驗材料    NC裸鼠Balb c裸鼠
試劑、試劑盒    肝癌外科手術(shù)切除標本Hanks液戊*鈉甲醛石蠟
儀器、耗材    針頭光學(xué)顯微鏡手術(shù)刀剪刀紗布消毒液口罩
實驗步驟    
一、間接肝原位移植瘤模型的制備

1.  用新鮮的肝癌外科手術(shù)切除標本（來自長海醫(yī)院，患者為1名47歲男性，病理診斷：肝左葉肝細胞癌，粗梁型，Ⅱ級），在Hanks液中，去除壞死組織和非癌組織后切成1～2 mm3小塊。

2.  取2塊瘤組織，在離體40 min內(nèi)用粗針頭植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤長到直徑約1 cm時切取腫瘤，在Hanks液中，去除壞死組織后切成1～2 mm3小塊，裸鼠用戊*鈉腹腔麻醉后，行左上腹橫切口，暴露肝臟。

3.  取上述2塊瘤組織，在離體40 min內(nèi)用粗針頭植入裸鼠肝右葉深部實質(zhì)內(nèi)，全層關(guān)腹。
 
二、直接肝原位移植瘤模型的制備

1.  同一例新鮮肝癌手術(shù)切除標本，處理方法同皮下移植，裸鼠處理同間接肝原位移植，取2塊瘤組織，在離體40 min內(nèi)用粗針頭直接植入裸鼠肝右葉深部實質(zhì)內(nèi)。
 
2.  皮下移植瘤模型和腹腔內(nèi)移植瘤模型的制備。
 
三、病理檢查和相關(guān)指標檢測
 
1.  解剖和組織學(xué)檢查

（1）所有裸鼠接種后，分組分籠飼養(yǎng)，自由進食，每天觀察1～2次。

（2）當裸鼠處于全身衰竭狀態(tài)時處死并作大體解剖，對接種瘤和轉(zhuǎn)移瘤分別進行觀察、測量，記錄腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移情況，重要器官（主要為肝和肺）經(jīng)10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟制片，光學(xué)顯微鏡檢查。
 
2.  周圍血甲胎蛋白(AFP)檢測

處死前，均采用摘眼球采血的方法獲得血液，用生化法檢測AFP的分泌量。

3.  瘤細胞DNA含量分析

留取部分移植瘤標本采用流式細胞術(shù)進行DNA含量分析。
 
收起 
其他    
一、實驗討論 

目前，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是其術(shù)后長期存活的主要障礙。為了研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機制，建立接近于人體的腫瘤動物模型顯得尤為重要。早期建立的動物移植瘤模型，移植瘤雖能維持來源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)和生化特性，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而影響了它在研究人類腫瘤轉(zhuǎn)移特性方面的價值。進一步研究表明，人癌在宿主體內(nèi)表達侵襲轉(zhuǎn)移能力，不但需要具備合適的移植環(huán)境，而且還依賴于瘤細胞之間、瘤細胞與宿主之間的相互作用。

近年來，根據(jù)原位移植理論建立起來的人癌瘤原位移植模型克服了這一缺陷，它不僅維持了原有瘤組織的結(jié)構(gòu)，而且還保持了人體瘤的絕大部分生物學(xué)特性，特別是轉(zhuǎn)移特性，它在宿主體內(nèi)能以類似于患者體內(nèi)的方式顯示其惡性行為。在這一新型模型的啟發(fā)下，人們相繼陸續(xù)建立了人類多種癌瘤的裸鼠原位移植瘤模型，為人類更好地研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機制提供了理想的工具。

Sun等采用組織學(xué)完整的患者肝癌標本，在裸鼠體內(nèi)建立了人肝癌原位移植瘤模型LCI-D20，該模型具有很高的自發(fā)轉(zhuǎn)移率，與裸鼠皮下移植瘤模型相比，雖然其組織學(xué)特征相似，但兩者的轉(zhuǎn)移能力卻是截然不同的，肝內(nèi)原位移植瘤自發(fā)轉(zhuǎn)移率達100％，而皮下移植瘤卻罕見有轉(zhuǎn)移。LCL-D20*不足在于移植瘤存活率低（1/16）。

Yamada 等用來自人肝膽管細胞癌細胞株接種裸鼠皮下形成皮下移植瘤和通過脾血管注射形成肝移植瘤，研究亦發(fā)現(xiàn)肝移植瘤轉(zhuǎn)移率明顯高于皮下移植瘤（100% vs 20%）。

Kimura等和Kuo 等研究后亦得出了類似的結(jié)論。我們參照上述實驗方法，并加以改進，先建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，然后再接種裸鼠肝內(nèi)建立原位移植模型，其原理是先讓人肝癌組織在裸鼠皮下適應(yīng)裸鼠體內(nèi)環(huán)境，然后再接種于肝臟，從而保證了移植瘤的存活率。研究表明，該模型與直接肝原位移植瘤模型一樣能充分展示人肝癌的生物學(xué)特性，與裸鼠皮下和腹腔移植瘤相比，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力均優(yōu)于后者。

為了探討原位與皮下移植腫瘤在腫瘤生物學(xué)行為上產(chǎn)生差異的機制，可以對原位與皮下移植瘤分別進行p53等癌基因表達和多種化療藥物治療研究，發(fā)現(xiàn)原位移植瘤p53表達的強度明顯高于皮下移植瘤，且兩者對多種化療藥物的敏感性亦是不同的。造成這種差異的原因可能在于腫瘤所處的微環(huán)境不同，從而影響了其生物學(xué)特性的發(fā)揮。

Fukumura 等通過對裸鼠皮下和肝內(nèi)結(jié)腸癌移植瘤的實驗后得出肝微環(huán)境對結(jié)腸癌移植瘤的血管形成和微循環(huán)建立的影響與皮下微環(huán)境對移植瘤的影響是不同的。

Cui 等指出，腫瘤的局部侵襲是發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提，只有具備局部侵襲能力的腫瘤才能有轉(zhuǎn)移的能力。皮下和腹腔內(nèi)種植的腫瘤由于受所處部位微環(huán)境的“不良”影響，往往在腫瘤周圍形成纖維包膜，從而限制了腫瘤侵襲周圍組織、淋巴管、血管的能力，所以轉(zhuǎn)移的機率就大為減少了，而原位移植部位本身就是腫瘤生長的“土壤”，在這里腫瘤獲得了充分的“滋潤”，腫瘤無包膜形成，因而能充分展示其生物學(xué)特性。說明要表達完整的轉(zhuǎn)移模式必須具備較好的植入環(huán)境，只有原位移植模型才能完整表達人類癌瘤的轉(zhuǎn)移特性。
 
移植瘤與原患者肝癌組織之間的形態(tài)學(xué)上的差異，可以認為移植的腫瘤組織其形態(tài)結(jié)構(gòu)特點只能反映取材部位瘤源的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。此外，移植瘤組織中適應(yīng)裸鼠體內(nèi)環(huán)境的、生長力強的細胞群體，可獲得優(yōu)勢，而弱的則在傳代過程中丟失。晚期，移植瘤由于宿主血供難以維持其生長需要，腫瘤發(fā)生壞死、出血，宿主也因衰竭而死亡。