MEF P0細胞培養(yǎng)的基本方法
復蘇:
- 將MEF P0細胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內細胞懸液轉移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內,以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
- 輕輕吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡。
- 按照MEF細胞說明書上建議的復蘇培養(yǎng)體系轉移至1個T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),加入培養(yǎng)液14 ml。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
- 復蘇第二天觀察,如死細胞較多,更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液,可以使細胞生長的更好。
傳代:
- 待細胞長到90%-100%滿時進行傳代,一般3-4天,具體視細胞生長情況而定。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入2.5 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內消化細胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
- 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化。
- 多次輕輕吹打細胞,制成單細胞懸液。
- 按照1:2-1:3的比例進行傳代。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
凍存:
- 按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液。
- 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經預冷的凍存液,懸浮細胞。
- 按每支凍存管內加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內,標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內,-80℃過一夜,轉入液氮。
凍存液配方:
MEF*培養(yǎng)液80%,F(xiàn)BS10%,DMSO 10%
Mitomycin C處理:
- 一般地,P0代MEF細胞傳至P3代時,可以進行Mitomycin C(Sigma,M0503)處理。處理過后的MEF細胞不再增殖,可直接作為feeder使用。
- 傳至P3代的MEF細胞長至80%以上時,吸出舊的MEF*培養(yǎng)液,加入含Mitomycin C(終濃度10 mg/ml )的新鮮MEF*培養(yǎng)液(以T75培養(yǎng)瓶為例,加入培養(yǎng)液的體積為10ml )。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時。
- 吸出培養(yǎng)液,用PBS快速洗4遍以去除殘余的Mitomycin C。
- 消化細胞、細胞計數(shù)并凍存。一般地,一個T25培養(yǎng)瓶鋪1′106細胞。
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