MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

復(fù)蘇：

1. 將MEF P0細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
4. 輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 按照MEF細(xì)胞說(shuō)明書上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個(gè)T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入培養(yǎng)液14 ml。
6. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7. 復(fù)蘇第二天觀察，如死細(xì)胞較多，更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)的更好。

傳代：

1. 待細(xì)胞長(zhǎng)到90%-100%滿時(shí)進(jìn)行傳代，一般3-4天，具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
6. 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化。
7. 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
8. 按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

凍存：

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。
2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)一夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方： 
MEF*培養(yǎng)液80%，F(xiàn)BS10%，DMSO 10% 
                                   
Mitomycin C處理：

1. 一般地，P0代MEF細(xì)胞傳至P3代時(shí)，可以進(jìn)行Mitomycin C（Sigma，M0503）處理。處理過(guò)后的MEF細(xì)胞不再增殖，可直接作為feeder使用。
2. 傳至P3代的MEF細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上時(shí)，吸出舊的MEF*培養(yǎng)液，加入含Mitomycin C（終濃度10 mg/ml ）的新鮮MEF*培養(yǎng)液（以T75培養(yǎng)瓶為例，加入培養(yǎng)液的體積為10ml ）。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時(shí)。
3. 吸出培養(yǎng)液，用PBS快速洗4遍以去除殘余的Mitomycin C。
4. 消化細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)并凍存。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶鋪1′106細(xì)胞。