MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法
復(fù)蘇:
- 將MEF P0細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
- 輕輕吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。
- 按照MEF細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個(gè)T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),加入培養(yǎng)液14 ml。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 復(fù)蘇第二天觀察,如死細(xì)胞較多,更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液,可以使細(xì)胞生長(zhǎng)的更好。
傳代:
- 待細(xì)胞長(zhǎng)到90%-100%滿時(shí)進(jìn)行傳代,一般3-4天,具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入2.5 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動(dòng),使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
- 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化。
- 多次輕輕吹打細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。
- 按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存:
- 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái),制成細(xì)胞懸液。
- 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。
- 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過(guò)一夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
MEF*培養(yǎng)液80%,F(xiàn)BS10%,DMSO 10%
Mitomycin C處理:
- 一般地,P0代MEF細(xì)胞傳至P3代時(shí),可以進(jìn)行Mitomycin C(Sigma,M0503)處理。處理過(guò)后的MEF細(xì)胞不再增殖,可直接作為feeder使用。
- 傳至P3代的MEF細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上時(shí),吸出舊的MEF*培養(yǎng)液,加入含Mitomycin C(終濃度10 mg/ml )的新鮮MEF*培養(yǎng)液(以T75培養(yǎng)瓶為例,加入培養(yǎng)液的體積為10ml )。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時(shí)。
- 吸出培養(yǎng)液,用PBS快速洗4遍以去除殘余的Mitomycin C。
- 消化細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)并凍存。一般地,一個(gè)T25培養(yǎng)瓶鋪1′106細(xì)胞。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。