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MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

來(lái)源:上海極威生物科技有限公司   2015年10月09日 21:47  

MEF P0細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

復(fù)蘇:

  1. 將MEF P0細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
  2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
  3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
  4. 輕輕吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。
  5. 按照MEF細(xì)胞說(shuō)明書(shū)上建議的復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至1個(gè)T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),加入培養(yǎng)液14 ml。
  6. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
  7. 復(fù)蘇第二天觀察,如死細(xì)胞較多,更換新鮮的MEF*培養(yǎng)液,可以使細(xì)胞生長(zhǎng)的更好。

傳代:

  1. 待細(xì)胞長(zhǎng)到90%-100%滿時(shí)進(jìn)行傳代,一般3-4天,具體視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。
  2. 吸除廢液。
  3. 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
  4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動(dòng),使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
  5. 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
  6. 加2.5 ml MEF*培養(yǎng)液終止消化。
  7. 多次輕輕吹打細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。
  8. 按照1:2-1:3的比例進(jìn)行傳代。
  9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

凍存:

  1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái),制成細(xì)胞懸液。
  2. 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。
  3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
  4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過(guò)一夜,轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方: 
MEF*培養(yǎng)液80%,F(xiàn)BS10%,DMSO 10% 
                                   
Mitomycin C處理:

  1. 一般地,P0代MEF細(xì)胞傳至P3代時(shí),可以進(jìn)行Mitomycin C(Sigma,M0503)處理。處理過(guò)后的MEF細(xì)胞不再增殖,可直接作為feeder使用。
  2. 傳至P3代的MEF細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上時(shí),吸出舊的MEF*培養(yǎng)液,加入含Mitomycin C(終濃度10 mg/ml )的新鮮MEF*培養(yǎng)液(以T75培養(yǎng)瓶為例,加入培養(yǎng)液的體積為10ml )。37℃培養(yǎng)箱溫育處理3小時(shí)。
  3. 吸出培養(yǎng)液,用PBS快速洗4遍以去除殘余的Mitomycin C。
  4. 消化細(xì)胞、細(xì)胞計(jì)數(shù)并凍存。一般地,一個(gè)T25培養(yǎng)瓶鋪1′106細(xì)胞。

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