人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（hiPS）培養(yǎng)方法

以下試劑和方法來自ATCC，僅供參考。若選用其它品牌的培養(yǎng)液請(qǐng)與您的試劑提供商。 
hiPS無飼養(yǎng)層*培養(yǎng)液（ATCC，ACS-3002），hiPS無飼養(yǎng)層消化液（ATCC，ACS-3010），hiPS無飼養(yǎng)層凍存液（ATCC， ACS-3020），基質(zhì)膠（ATCC，ACS-3035），ROCK Inhibitor Y27632（ATCC，ACS-3030）

復(fù)蘇：

1. 將人iPS細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 用1 ml移液器輕柔地將凍存管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中。
3. 在上述離心管內(nèi)逐滴加入溫育好的4 ml hiPS無飼養(yǎng)層*培養(yǎng)液，一邊加一邊晃動(dòng)離心管。
4. 離心1000 rpm，5 min。
5. 將上清丟棄，輕彈離心管底部使細(xì)胞團(tuán)松散。
6. 加入1ml含有ROCK Inhibitor Y27632的hiPS無飼養(yǎng)層*培養(yǎng)液，非常輕柔地吹打2-3次。不可過度吹打，避免細(xì)胞被分散成單細(xì)胞。
7. 將鋪過基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱取出，吸掉多余的液體，加入含有ROCK Inhibitor Y27632的培養(yǎng)液3 ml。
8. 將第6步中離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到皿內(nèi)，使細(xì)胞鋪散均勻，置37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
9. 24h后，換新鮮的不加ROCK Inhibitor Y27632的hiPS無飼養(yǎng)層*培養(yǎng)液。
10. 每天換液。ROCK Inhibitor Y27632僅在復(fù)蘇和傳代時(shí)添加（1:1000），日常換液不用添加。

傳代：

1. 將所需的所有試劑均在37℃水浴溫?zé)帷?/li>
2. 將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，用DPBS漂洗2遍，棄掉。
3. 加入2 ml hiPS無飼養(yǎng)層消化液。
4. 37℃孵育10-15分鐘，期間注意觀察，直到每個(gè)克隆的邊緣都向中心卷起。
5. 將hiPS無飼養(yǎng)層消化液吸掉，輕輕地加入4ml DMEM:F12培養(yǎng)液并晃動(dòng)培養(yǎng)皿，吸掉。
6. 加入2 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的培養(yǎng)液，用1 ml移液器吹打皿底或用無菌的細(xì)胞刮使細(xì)胞脫落。避免吹打過度。
7. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 ml離心管，并再次加入3 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的培養(yǎng)液將培養(yǎng)皿沖洗一次，收集到離心管內(nèi)。
8. 離心1000 rpm，5 min。
9. 將上清丟棄，輕彈離心管底部使細(xì)胞團(tuán)松散。
10. 加入2 ml含有ROCK Inhibitor Y27632的hiPS無飼養(yǎng)層*培養(yǎng)液，非常輕柔地吹打2-3次。不可過度吹打，避免細(xì)胞被分散成單細(xì)胞。
11. 將細(xì)胞分到預(yù)鋪了基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。
12. 每天換液，4-5天傳代一次，傳代比例為1:2-1:6。當(dāng)出現(xiàn)下列任何一種情況時(shí)，需要進(jìn)行傳代：細(xì)胞匯合度達(dá)到90%；干細(xì)胞克隆過大，*細(xì)胞生長不良；克隆有開始分化的跡象。

冷凍：

1. 參照傳代步驟1-9，hiPS無飼養(yǎng)層凍存液4℃保存，不需要預(yù)熱。
2. 在離心管內(nèi)加入2 ml細(xì)胞凍存液，輕輕吹打，避免過度吹打。
3. 將細(xì)胞懸液分裝到貼好標(biāo)簽的凍存管內(nèi)，每管0.5 ml。
4. 將凍存管放入程序降溫儀，置-80℃。
5. 24h后，凍存管轉(zhuǎn)入液氮保存。