人胚胎干細(xì)胞（hES）培養(yǎng)

MEF細(xì)胞鋪制：

1. 在T25培養(yǎng)瓶中加入5% Matrigel，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少放置30 min以上。
2. 吸除Matrigel，加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養(yǎng)液。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加入5 ml MEF*培養(yǎng)液。
3. 按實(shí)驗(yàn)需要復(fù)蘇MEF若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以    1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液1 ml，重懸后按照一個(gè)T25培養(yǎng)瓶鋪1′106的MEF細(xì)胞，平均加入到T25 培養(yǎng)瓶，輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。48h以后可以傳入人胚胎干細(xì)胞。
5. 復(fù)蘇或傳代hES細(xì)胞前，將T25培養(yǎng)瓶中的MEF*培養(yǎng)液吸除，加入2 ml hES*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的hES*培養(yǎng)液待用。

復(fù)蘇：

1. 將hES細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml hES*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的hES*培養(yǎng)液2-3 ml，吹打一次使細(xì)胞懸浮。
4. 轉(zhuǎn)移至1個(gè)已經(jīng)鋪好MEF細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
5. 復(fù)蘇第二天不換液，第三天起每天更換hES細(xì)胞*培養(yǎng)液。

注意：復(fù)蘇后48小時(shí)換液，期間不要挪動(dòng)細(xì)胞。hES復(fù)蘇后大約4-5天才開(kāi)始有克隆出現(xiàn)。

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第7-10天傳代，正常傳代為7天一次。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使之覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至克隆邊緣大部分脫落（一般需要30-60 min）。
6. 用10 ml移液管輕輕吹打，將克隆吹下，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除，加入hES*培養(yǎng)液3 ml，放置一會(huì)，待克隆自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除。
7. 加入的hES*培養(yǎng)液3 ml，用10 ml移液管吹打2-3次，細(xì)胞自然沉降，將上層吹打的過(guò)小的克隆及培養(yǎng)液吸除，加入hES*培養(yǎng)液3 ml，懸浮細(xì)胞，按照1:4的比例進(jìn)行傳代。
8. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
9. 第二天不換液，第三天起每天換液，換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。

注意：復(fù)蘇后48小時(shí)換液，期間不要挪動(dòng)細(xì)胞。hES復(fù)蘇后大概4-5天才開(kāi)始有克隆出現(xiàn)。

凍存：

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。
2. 細(xì)胞自然沉降，吸除上層培養(yǎng)液，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，輕輕懸浮細(xì)胞。
3. 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過(guò)一夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方： 
hES*培養(yǎng)液60%，ES級(jí)FBS 30%，DMSO 10%