人胚胎干細(xì)胞(hES)培養(yǎng)
MEF細(xì)胞鋪制:
- 在T25培養(yǎng)瓶中加入5% Matrigel,搖勻后覆蓋底面即可,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少放置30 min以上。
- 吸除Matrigel,加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養(yǎng)液。一般地,一個T25培養(yǎng)瓶中加入5 ml MEF*培養(yǎng)液。
- 按實驗需要復(fù)蘇MEF若干支。將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液1 ml,重懸后按照一個T25培養(yǎng)瓶鋪1′106的MEF細(xì)胞,平均加入到T25 培養(yǎng)瓶,輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。48h以后可以傳入人胚胎干細(xì)胞。
- 復(fù)蘇或傳代hES細(xì)胞前,將T25培養(yǎng)瓶中的MEF*培養(yǎng)液吸除,加入2 ml hES*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的hES*培養(yǎng)液待用。
復(fù)蘇:
- 將hES細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml hES*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的hES*培養(yǎng)液2-3 ml,吹打一次使細(xì)胞懸浮。
- 轉(zhuǎn)移至1個已經(jīng)鋪好MEF細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
- 復(fù)蘇第二天不換液,第三天起每天更換hES細(xì)胞*培養(yǎng)液。
注意:復(fù)蘇后48小時換液,期間不要挪動細(xì)胞。hES復(fù)蘇后大約4-5天才開始有克隆出現(xiàn)。
傳代:
- 一般在復(fù)蘇后第7-10天傳代,正常傳代為7天一次。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入4-5 ml的1 mg / ml的Collagenase-type IV至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使之覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至克隆邊緣大部分脫落(一般需要30-60 min)。
- 用10 ml移液管輕輕吹打,將克隆吹下,細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,放置一會,待克隆自然沉降后將上層Collagenase-type IV吸除,加入hES*培養(yǎng)液3 ml,放置一會,待克隆自然沉降后將上層培養(yǎng)液吸除。
- 加入的hES*培養(yǎng)液3 ml,用10 ml移液管吹打2-3次,細(xì)胞自然沉降,將上層吹打的過小的克隆及培養(yǎng)液吸除,加入hES*培養(yǎng)液3 ml,懸浮細(xì)胞,按照1:4的比例進(jìn)行傳代。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 第二天不換液,第三天起每天換液,換液前顯微鏡下將分化的克隆挑除。
注意:復(fù)蘇后48小時換液,期間不要挪動細(xì)胞。hES復(fù)蘇后大概4-5天才開始有克隆出現(xiàn)。
凍存:
- 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來,制成細(xì)胞懸液。
- 細(xì)胞自然沉降,吸除上層培養(yǎng)液,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,輕輕懸浮細(xì)胞。
- 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過一夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
hES*培養(yǎng)液60%,ES級FBS 30%,DMSO 10%
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