小鼠胚胎干細胞(mES細胞)、小鼠iPS細胞培養(yǎng)
MEF細胞鋪制:
- 在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于37℃細胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。
- 吸除0.2%明膠,加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養(yǎng)液。一般地,一個T25培養(yǎng)瓶中加入5 ml MEF*培養(yǎng)液。
- 按實驗需要:小鼠胚胎干細胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF;小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF,復(fù)蘇MEF細胞若干支。將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以 1000 rpm,離心5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液1 ml,重懸后按照一個T25培養(yǎng)瓶鋪1′106的MEF細胞,平均加入到T25培養(yǎng)瓶中,輕輕搖勻后置于37℃細胞培養(yǎng)箱。24 h以后可以傳入小鼠胚胎干細胞或小鼠iPS細胞。
- 復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細胞或小鼠iPS細胞前,將T25培養(yǎng)瓶中的MEF*培養(yǎng)液吸除,加入2 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液待用。
復(fù)蘇:
- 將小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
- 重復(fù)吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡。
- 轉(zhuǎn)移至1個已經(jīng)鋪好MEF細胞的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
- 每天更換小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液。
傳代:
- 一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代,視克隆大小和密度而定。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入1.0 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
- 加2 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液終止消化。
- 多次輕輕吹打細胞,制成單細胞懸液。
- 加入足量的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞*培養(yǎng)液,吹打混勻,細胞懸液分裝到鋪好MEF細胞的T25培養(yǎng)瓶中。一般地,一個T25培養(yǎng)瓶加入5-6 ml培養(yǎng)液。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 每天換液。
傳代比例:1:4-1:7
凍存:
- 按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液。
- 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細胞。
- 按每支存管內(nèi)加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過一夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
小鼠胚胎干細胞*培養(yǎng)液或小鼠iPS*培養(yǎng)液60%,ES級FBS 30%,DMSO 10%
附:小鼠胚胎干細胞與MEF細胞分離的簡易方法(差速貼壁法):
- 培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細胞,按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞*培養(yǎng)液重懸細胞,吹打混勻,細胞懸液分裝到無MEF細胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶(一般地,一個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞,在一個10 cm培養(yǎng)皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與MEF細胞)中。
- 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時。
- 1小時后,絕大部分MEF細胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。
- 收取培養(yǎng)液,進行后續(xù)實驗。
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