小鼠胚胎干細(xì)胞（mES細(xì)胞）、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)

MEF細(xì)胞鋪制：

1. 在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。
2. 吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的MEF*培養(yǎng)液。一般地，一個T25培養(yǎng)瓶中加入5 ml MEF*培養(yǎng)液。
3. 按實驗需要：小鼠胚胎干細(xì)胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF，復(fù)蘇MEF細(xì)胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含2 ml MEF*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以    1000 rpm，離心5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的MEF*培養(yǎng)液1 ml，重懸后按照一個T25培養(yǎng)瓶鋪1′106的MEF細(xì)胞，平均加入到T25培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h以后可以傳入小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠iPS細(xì)胞。
5. 復(fù)蘇或傳代小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠iPS細(xì)胞前，將T25培養(yǎng)瓶中的MEF*培養(yǎng)液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液待用。

復(fù)蘇：

1. 將小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
2. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
4. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
5. 轉(zhuǎn)移至1個已經(jīng)鋪好MEF細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
6. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液。

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
6. 加2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液終止消化。
7. 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
8. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞*培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到鋪好MEF細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶中。一般地，一個T25培養(yǎng)瓶加入5-6 ml培養(yǎng)液。
9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
10. 每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存： 

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來，制成細(xì)胞懸液。
2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過一夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方： 
小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液或小鼠iPS*培養(yǎng)液60%，ES級FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細(xì)胞與MEF細(xì)胞分離的簡易方法（差速貼壁法）： 

1. 培養(yǎng)中的小鼠胚胎干細(xì)胞，按傳代的操作方法將細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單細(xì)胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細(xì)胞*培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到無MEF細(xì)胞的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶（一般地，一個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞，在一個10 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細(xì)胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細(xì)胞與MEF細(xì)胞）中。
2. 培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1小時。
3. 1小時后，絕大部分MEF細(xì)胞已貼在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細(xì)胞仍然懸浮在培養(yǎng)液中。
4. 收取培養(yǎng)液，進(jìn)行后續(xù)實驗。