小鼠胚胎干細(xì)胞（mES細(xì)胞）、小鼠iPS無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)
復(fù)蘇： 

1. 在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。
2. 吸除0.2%明膠，加入事先水浴加熱至37℃的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml。
3. 將小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。
4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi)，以1000 rpm，離心5 min。
5. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液2 ml，吹打懸浮。
6. 重復(fù)吹打，制成單細(xì)胞懸液，盡量避免氣泡。
7. 轉(zhuǎn)移至1個(gè)已經(jīng)包被過明膠的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液。

傳代：

1. 一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代，視克隆大小和密度而定。
2. 吸除廢液。
3. 用PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。
4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶（含EDTA）至培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
5. 在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞層全部脫落（一般需要1-2 min）。
6. 加2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。
7. 多次輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。
8. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打混勻，細(xì)胞懸液分裝到預(yù)先包被過0.2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中。一般地，一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加入5-6 ml培養(yǎng)液。
9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
10. 每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái)，制成細(xì)胞懸液。
2. 以1000 rpm，離心5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液，懸浮細(xì)胞。
3. 按每支存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi)，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，-80℃過一夜，轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方： 
小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠iPS培養(yǎng)液80%，ES級(jí)FBS 10%，DMSO 10%