小鼠胚胎干細胞(mES細胞)、小鼠iPS無飼養(yǎng)層培養(yǎng)
復(fù)蘇:
- 在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于37℃細胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。
- 吸除0.2%明膠,加入事先水浴加熱至37℃的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液5 ml。
- 將小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
- 重復(fù)吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡。
- 轉(zhuǎn)移至1個已經(jīng)包被過明膠的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
- 每天更換小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液。
傳代:
- 一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代,視克隆大小和密度而定。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入1.0 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
- 加2 ml小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液終止消化。
- 多次輕輕吹打細胞,制成單細胞懸液。
- 加入足量的小鼠胚胎干細胞、小鼠iPS細胞培養(yǎng)液,吹打混勻,細胞懸液分裝到預(yù)先包被過0.2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中。一般地,一個T25培養(yǎng)瓶中加入5-6 ml培養(yǎng)液。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 每天換液。
傳代比例:1:4-1:7
凍存:
- 按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液。
- 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細胞。
- 按每支存管內(nèi)加入500 ml細胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過一夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)液或小鼠iPS培養(yǎng)液80%,ES級FBS 10%,DMSO 10%
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