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小鼠胚胎干細(xì)胞(mES細(xì)胞)、小鼠iPS無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)

來(lái)源:上海極威生物科技有限公司   2015年10月10日 11:31  

小鼠胚胎干細(xì)胞(mES細(xì)胞)、小鼠iPS無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)
復(fù)蘇: 

  1. 在T25培養(yǎng)瓶中加入0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱至少放置15 min以上。
  2. 吸除0.2%明膠,加入事先水浴加熱至37℃的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml。
  3. 將小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
  4. 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
  5. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
  6. 重復(fù)吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。
  7. 轉(zhuǎn)移至1個(gè)已經(jīng)包被過(guò)明膠的T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
  8. 每天更換小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液。

傳代:

  1. 一般在復(fù)蘇后第2-3天傳代,視克隆大小和密度而定。
  2. 吸除廢液。
  3. 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
  4. 加入1.0 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動(dòng),使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
  5. 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要1-2 min)。
  6. 加2 ml小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。
  7. 多次輕輕吹打細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。
  8. 加入足量的小鼠胚胎干細(xì)胞、小鼠iPS細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打混勻,細(xì)胞懸液分裝到預(yù)先包被過(guò)0.2%明膠的T25培養(yǎng)瓶中。一般地,一個(gè)T25培養(yǎng)瓶中加入5-6 ml培養(yǎng)液。
  9. 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
  10. 每天換液。

傳代比例:1:4-1:7

凍存:

  1. 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來(lái),制成細(xì)胞懸液。
  2. 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。
  3. 按每支存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱(chēng)、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
  4. 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過(guò)一夜,轉(zhuǎn)入液氮。

凍存液配方: 
小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠iPS培養(yǎng)液80%,ES級(jí)FBS 10%,DMSO 10% 

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