小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
復(fù)蘇:
- 將小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內(nèi)用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染。
- 將凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含3-4 ml小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液的15 ml離心管內(nèi),以1000 rpm,離心5 min。
- 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml,吹打懸浮。
- 輕輕吹打,制成單細(xì)胞懸液,盡量避免氣泡。
- 按照小鼠神經(jīng)干細(xì)胞說明書中建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)移至一個T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),加入培養(yǎng)液6 ml。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
- 復(fù)蘇第二天觀察,如死細(xì)胞較多,更換新鮮的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液,可以使細(xì)胞生長的更好。
傳代:
- 待細(xì)胞長到80%滿時進(jìn)行傳代,一般2-3天,具體視細(xì)胞生長情況。
- 吸除廢液。
- 用PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍。
- 加入1-2 ml的0.05%胰酶(含EDTA)至培養(yǎng)瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞。
- 在顯微鏡下觀察,直至細(xì)胞層全部脫落(一般需要5-15 min)。
- 加2 ml小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液終止消化。
- 1000 rpm離心5 min,去上清,加入小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液2 ml。
- 多次輕輕吹打細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液。
- 按照1:4-1:10的比例進(jìn)行傳代。
- 放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
凍存:
- 按傳代的方法將細(xì)胞消化下來,制成細(xì)胞懸液。
- 以1000 rpm,離心5 min,棄上清,逐滴加入已經(jīng)預(yù)冷的凍存液,懸浮細(xì)胞。
- 按每支凍存管內(nèi)加入500 ml細(xì)胞懸液分裝到凍存管內(nèi),標(biāo)記細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存日期等基本信息。
- 將凍存管置于程序降溫盒內(nèi),-80℃過一夜,轉(zhuǎn)入液氮。
凍存液配方:
小鼠神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)液 90%,DMSO 10%
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