自備物品

1.酶標(biāo)儀(盡量提前預(yù)熱)

2.微量加液器、吸頭

3.蒸餾水或去離子水以及濾紙

樣本的采集及保存

一般的生物標(biāo)本包括有：

血液、體液、內(nèi)臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物等

一般為無菌操作，低溫保存(-80℃、液氮)

一．如果采集的實質(zhì)器官則要求：

1、 器官實質(zhì)不能太小

2、 以采集實質(zhì)性病灶區(qū)為佳：如淋巴結(jié)、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳

3、 同一病例裝入同一容器，并做好標(biāo)記

4、 應(yīng)在0-8℃的低溫儲存和運輸

5、 實質(zhì)性器官的處理：

5.1、取實質(zhì)性器官約0.5mg左右，充分剪碎或研磨

5.2、加入約500ul的/生理鹽水，充分混勻

5.3、離心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作為待檢標(biāo)本(切勿反復(fù)凍融)

二．體液(常見的包括血清、血漿、唾液以及尿液等)的處理方式

1、血液包括血漿和血清，它們的主要區(qū)別就是：血清凝血而血漿不凝血，所以它們的處理方式也就不一樣

1.1、采集血漿時一般不加抗凝劑(主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽)，采集后立即離心800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

1.2、如要采集血清，一般要加入總體積1%的抗凝劑，采集后先室溫或4℃靜置半小時后，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

2、胃液和唾液的采集方式一般現(xiàn)采現(xiàn)用，但是一般飯后半小時內(nèi)不易采集，因為剛進(jìn)食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶，的采集的時間時空腹采集；

3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的，即現(xiàn)采現(xiàn)用，但是一般隔夜尿不采集；

4、組織提取液如肺泡灌洗液等，采集后離心分離，800-1000rmp x 5min，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

三．糞便以及天然孔排泄物：采集后一般現(xiàn)用/生理鹽水溶解，充分混勻，800-1000rmp x 5min分離，取上清，-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

四．活檢組織一般進(jìn)行穿刺技術(shù)，zui常見的就是肝活檢，像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類型的肝硬化等進(jìn)行活檢簡單方便、準(zhǔn)確。

三、表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)

(一)真核表達(dá)產(chǎn)物

1、 細(xì)胞上清(分泌性蛋白)

1.2、貼壁細(xì)胞或半貼壁，直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

1.2、不貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管，500-800rmp x10min，吸取上清至另一10ml離心管中，10000rmp x10min， -20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2、 細(xì)胞裂解物(非分泌性蛋白)

2.1、貼壁細(xì)胞或半貼壁，直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出，然后用001M (pH 7.4)將細(xì)胞吹下至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2.2、不貼壁細(xì)胞，將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至另一10ml離心管中，0.01M (pH 7.4)重懸，500-800rmp x10min，棄上清，沉淀移至1.5ml離心管中， DDW重懸，置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清， -20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

(二)原核(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)產(chǎn)物

1、表達(dá)上清(非融合性蛋白)

直接將培養(yǎng)物和上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

2、菌體裂解物(融合性蛋白)

直接將培養(yǎng)物和上清吸出，10000rmp x10min，棄上清，沉淀用洗一遍，500-800rmp x10min，棄上清，DDW重懸沉淀，冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20℃或4℃保存，作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù)，如有需要可進(jìn)行透析或純化處理；

注意事項

1.試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存。實驗操作中必須使用一次性吸頭，避免交叉污染。

2．加樣：加樣時，要控制加樣速度，避免*孔與zui后一孔之見的時間間隔過大，否則將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時間，從而影響實驗的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性；一般加樣時間控制在10分鐘內(nèi)，如果樣本數(shù)量過多，可使用多道移液器。

3.孵育：樣品要在密閉的容器內(nèi)進(jìn)行孵育，嚴(yán)格按照說明書上規(guī)定的孵育時間和溫度進(jìn)行。

4.洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中的殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，同時要消除板底殘留的液體和手指痕跡，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，10分鐘左右)，如果顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

6.建議實驗前預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，計算結(jié)果時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

7.建議使用本試劑盒時先做預(yù)實驗(即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線，試用幾個標(biāo)本)，如果對本試劑盒有任何疑問，可和所購經(jīng)銷商，如果因運輸過程導(dǎo)致試劑盒失效，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。

操作步驟

1. 取出試劑盒，于室溫(20-25℃)放置15-30分鐘。實驗過程應(yīng)在室溫(20-25℃)內(nèi)進(jìn)行。

2. 取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。

3. 空白微孔中加入50μl的樣品，空白對照加入50μl的蒸餾水；

4. 在樣品孔中加入10μl的生物素；(不含空白對照孔,切忌：生物素只加樣品孔！)

5. 在各孔中加入100μl的酶標(biāo)記溶液；(不含空白對照孔)

6. 將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng) 1小時；(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)

7. 充分清洗酶標(biāo)板3-5次，保持各孔有充足的水壓；(濃縮洗滌液以1：100的比例與蒸餾水稀釋)

8. 酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙*拍干；

9. 各孔加入顯色劑A、B液各50μl；(不含空白對照孔)

10. 20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘；

11. 各孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)；

結(jié)果判斷

1. 30分鐘內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值；

2. 以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線圖；

3. 根據(jù)樣品的OD值查找對應(yīng)的濃度范圍；

4. 敏感度：0.1 ng/ml