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ELISA試劑盒技術(shù)樣本的原理和步驟

來(lái)源:上海極威生物科技有限公司   2015年11月04日 20:27  

自備物品

1.酶標(biāo)儀(盡量提前預(yù)熱)

2.微量加液器、吸頭

3.蒸餾水或去離子水以及濾紙

樣本的采集及保存

一般的生物標(biāo)本包括有:

血液、體液、內(nèi)臟器官、糞便、胃液、活檢組織、組織提取液、天然孔分泌物及各種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物等

一般為無(wú)菌操作,低溫保存(-80℃、液氮)

一.如果采集的實(shí)質(zhì)器官則要求:

1、 器官實(shí)質(zhì)不能太小

2、 以采集實(shí)質(zhì)性病灶區(qū)為佳:如淋巴結(jié)、心臟、非、肺、脾以及腸管等病毒、病菌聚集的地方為佳

3、 同一病例裝入同一容器,并做好標(biāo)記

4、 應(yīng)在0-8℃的低溫儲(chǔ)存和運(yùn)輸

5、 實(shí)質(zhì)性器官的處理:

5.1、取實(shí)質(zhì)性器官約0.5mg左右,充分剪碎或研磨

5.2、加入約500ul的/生理鹽水,充分混勻

5.3、離心5000rmp x10min,去上清

5.4、-20℃保存,作為待檢標(biāo)本(切勿反復(fù)凍融)

二.體液(常見(jiàn)的包括血清、血漿、唾液以及尿液等)的處理方式

1、血液包括血漿和血清,它們的主要區(qū)別就是:血清凝血而血漿不凝血,所以它們的處理方式也就不一樣

1.1、采集血漿時(shí)一般不加抗凝劑(主要為枸櫞酸鹽和檸檬酸鹽),采集后立即離心800-1000rmp x 5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

1.2、如要采集血清,一般要加入總體積1%的抗凝劑,采集后先室溫或4℃靜置半小時(shí)后,800-1000rmp x 5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

2、胃液和唾液的采集方式一般現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般飯后半小時(shí)內(nèi)不易采集,因?yàn)閯傔M(jìn)食的唾液中富含豐富的唾液淀粉酶,的采集的時(shí)間時(shí)空腹采集;

3、尿液的采集方式基本和唾液一樣的,即現(xiàn)采現(xiàn)用,但是一般隔夜尿不采集;

4、組織提取液如肺泡灌洗液等,采集后離心分離,800-1000rmp x 5min,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

三.糞便以及天然孔排泄物:采集后一般現(xiàn)用/生理鹽水溶解,充分混勻,800-1000rmp x 5min分離,取上清,-20℃或4℃保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

四.活檢組織一般進(jìn)行穿刺技術(shù),zui常見(jiàn)的就是肝活檢,像病毒性肝炎、脂肪肝、各種類(lèi)型的肝硬化等進(jìn)行活檢簡(jiǎn)單方便、準(zhǔn)確。

三、表達(dá)產(chǎn)物的技術(shù)

(一)真核表達(dá)產(chǎn)物

1、 細(xì)胞上清(分泌性蛋白)

1.2、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

1.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmp x10min,吸取上清至另一10ml離心管中,10000rmp x10min, -20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

2、 細(xì)胞裂解物(非分泌性蛋白)

2.1、貼壁細(xì)胞或半貼壁,直接將細(xì)胞培養(yǎng)上清吸出,然后用001M (pH 7.4)將細(xì)胞吹下至10ml離心管,500-800rmp x10min,棄上清,沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中, DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

2.2、不貼壁細(xì)胞,將培養(yǎng)基和細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml離心管,500-800rmp x10min,棄上清,沉淀移至另一10ml離心管中,0.01M (pH 7.4)重懸,500-800rmp x10min,棄上清,沉淀移至1.5ml離心管中, DDW重懸,置冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmp x10min,取上清, -20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

(二)原核(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)產(chǎn)物

1、表達(dá)上清(非融合性蛋白)

直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

2、菌體裂解物(融合性蛋白)

直接將培養(yǎng)物和上清吸出,10000rmp x10min,棄上清,沉淀用洗一遍,500-800rmp x10min,棄上清,DDW重懸沉淀,冰水浴中用超聲波裂解儀進(jìn)行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作為標(biāo)本進(jìn)行技術(shù),如有需要可進(jìn)行透析或純化處理;

注意事項(xiàng)

1.試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存。實(shí)驗(yàn)操作中必須使用一次性吸頭,避免交叉污染。

2.加樣:加樣時(shí),要控制加樣速度,避免*孔與zui后一孔之見(jiàn)的時(shí)間間隔過(guò)大,否則將會(huì)導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時(shí)間,從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性;一般加樣時(shí)間控制在10分鐘內(nèi),如果樣本數(shù)量過(guò)多,可使用多道移液器

3.孵育:樣品要在密閉的容器內(nèi)進(jìn)行孵育,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)上規(guī)定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行。

4.洗滌:洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中的殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指痕跡,避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.反應(yīng)時(shí)間的控制:加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,10分鐘左右),如果顏色較深,請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。

6.建議實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)樣品含量,如樣品濃度過(guò)高,應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)?jì)算結(jié)果時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

7.建議使用本試劑盒時(shí)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)(即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),試用幾個(gè)標(biāo)本),如果對(duì)本試劑盒有任何疑問(wèn),可和所購(gòu)經(jīng)銷(xiāo)商,如果因運(yùn)輸過(guò)程導(dǎo)致試劑盒失效,可要求調(diào)換,但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失。

操作步驟

1. 取出試劑盒,于室溫(20-25℃)放置15-30分鐘。實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在室溫(20-25℃)內(nèi)進(jìn)行。

2. 取出酶標(biāo)板,按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中。

3. 空白微孔中加入50μl的樣品,空白對(duì)照加入50μl的蒸餾水;

4. 在樣品孔中加入10μl的生物素;(不含空白對(duì)照孔,切忌:生物素只加樣品孔!)

5. 在各孔中加入100μl的酶標(biāo)記溶液;(不含空白對(duì)照孔)

6. 將酶標(biāo)板用封口膠密封后,37℃孵育反應(yīng) 1小時(shí);(在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度)

7. 充分清洗酶標(biāo)板3-5次,保持各孔有充足的水壓;(濃縮洗滌液以1:100的比例與蒸餾水稀釋)

8. 酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙*拍干;

9. 各孔加入顯色劑A、B液各50μl;(不含空白對(duì)照孔)

10. 20-25℃下避光反應(yīng)15分鐘;

11. 各孔加入50μl終止液,終止反應(yīng);

結(jié)果判斷

1. 30分鐘內(nèi)在波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值;

2. 以O(shè)D值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo),繪制曲線(xiàn)圖;

3. 根據(jù)樣品的OD值查找對(duì)應(yīng)的濃度范圍;

4. 敏感度:0.1 ng/ml

 

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