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ChIP的一般操作流程(第二天)

來源:上海一研生物科技有限公司   2015年12月04日 13:53  

ChIP的一般流程:

    甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結(jié)合---加入ProteinA,結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復合物,并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結(jié)合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯(lián),純化富集的DNA-片斷---PCR分析。

    在PCR分析這一塊,比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP(其實就是用ChIP的方法研究細胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,zui后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA);還有ChIP-chip(其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據(jù)公司的要求來準備樣品)。細胞

第二天:

(一)、免疫復合物的沉淀及清洗。

12、孵育過后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉(zhuǎn)2h。

13、4oC靜置10min后,700rpm離心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,在4oC顛轉(zhuǎn)10min,4oC靜置10min沉淀,700rpm離心1min,除去上清。

洗滌溶液:a.low salt wash buffer-one wash

b.highsalt wash buffer-one wash

c.LiCl wash buffer-one wash

d.TE buffer-two wash

15、清洗完畢后,開始洗脫。洗脫液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。

    每管加入250ul洗脫buffer,室溫下顛轉(zhuǎn)15min,靜置離心后,收集上清。重復洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500ul。細胞

16、解交聯(lián):每管中加入20ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2M)。

混勻,65oC解交聯(lián)過。

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