中檢所的微生物驗證范例

復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法驗證實驗


1. 樣品復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露），批號309315 、402021，生產(chǎn)廠家為香港歐化藥業(yè)有限公司。
2. 驗證用菌種 枯草桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、 黑曲霉CMCC(F)98003。
3. 方法 中國藥典有關(guān)微生物限度檢查法方法驗證試驗。 
4. 具體操作方法
4.1菌液制備：
(1) 取經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至10-5 ~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。
(2) 經(jīng)25 ℃培養(yǎng)18~24小時的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 ~10-7，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。
(3) 取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3~5ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1 ml +9 ml鹽水，逐管10倍稀釋為10-4，細(xì)菌數(shù)約為50~100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用。
4.2 供試液制備 吸取樣品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液90ml濃度均為1：10供試液，分別人工污染上述5種代表試驗菌株。
4.3 培養(yǎng)基稀釋法： 采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，再加15~20 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~48小時觀察結(jié)果細(xì)菌計數(shù)，測定回收率。結(jié)果見表：
4.4 回收率測定：
(1) 試驗組: 分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50~100個/ ml 試驗菌株同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24~72小時觀察結(jié)果。薄膜過濾法以zui后一次的沖洗液加入試驗菌.
(2) 活菌組 測定每一菌株的試驗菌數(shù)
(3) 供試液對照 測定供試品本底菌數(shù)
(4) 稀釋劑對照組
5 結(jié)果
菌落計數(shù)結(jié)果、常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法在復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查法的驗證結(jié)果見表1、2和表3。
表1 菌落計數(shù)（cfu/ml） 
實驗次數(shù) 金葡菌10-5 枯草桿菌10-5 白色念珠菌10-5 黑曲霉10-4 大腸埃希菌10-7
1 94、90 130、80 73、72 110、90 14、15
2 80、74 45、 23 128、108 110、120 54、34
3 153、150 78、 77 73、74 110、100 30、27
從表2結(jié)果可以看出: （1）采用常規(guī)方法檢驗復(fù)方磷酸可待因溶液供試品，人工污染5株代表菌株，該供試品對大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗均高于70%，可采用常規(guī)方法檢驗。（2）復(fù)方磷酸可待因?qū)瘘S色葡萄球菌、枯草桿菌有不同程度的抗菌活性，供試品回收率為0.02~29.2%，均低于70%。
表2 復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查方法驗證 （常規(guī)法） 
實驗次數(shù) 人工染菌回收率%
金葡菌 枯草桿菌 白色念珠菌 黑曲霉 大腸埃希菌
1 0.02 71.4 81.1 100.0 100.0
2 29.2 29.4 100.0 100.0 100.0
3 抑菌 抑菌 100.0 100.0 100.0

表3 培養(yǎng)基稀釋法（1ml加2個平皿）復(fù)方磷酸可待因微生物限度檢查驗證 
實驗次數(shù) 人工染菌回收率%
金葡菌 枯草桿菌
1 80.7 100.0
2 91.4 100.0
表3中的結(jié)果證明，采用培養(yǎng)基稀釋法可消除供試品對人工污染金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑菌作用。回收率達(dá)到70%以上。因此，培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）可用于復(fù)方磷酸可待因（歐博士止咳露）的微生物限度檢查。
6 結(jié)論
根據(jù)驗證試驗結(jié)果，確定復(fù)方磷可待因（歐博士止咳露）溶液微生物限度檢查法為細(xì)菌數(shù)測定可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿）測定，霉菌數(shù)可采用常規(guī)法測定。
注：常規(guī)法為1ml供試液加15~20ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基；培養(yǎng)基稀釋法則為0.5ml供試液加15~20ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基為2倍稀釋，0.2ml供試液加15~20ml菌落計數(shù)用培養(yǎng)基為5倍稀釋。