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基因組DNA轉(zhuǎn)染

來源:上海一研生物科技有限公司   2016年02月22日 14:08  

    本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細胞,這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性,這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”,也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細胞建立細胞株。若以獲取 “轉(zhuǎn)化灶”為目的,可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導(dǎo)入受體細胞即可,其方法如下: 

1.基因組DNA轉(zhuǎn)染: 

(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液 

NaCl 8.0g 

Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65 

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?nbsp;

加溫水至 1000mL 

(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。 

(3)取供體基因組DNA50~100μg,加3M NaCl或醋酸鈉,使zui終濃度至0.3M混勻。 

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘,去上清。 

(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié)),置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現(xiàn)微濁蘭色時,即可用于轉(zhuǎn)染細胞。 

(6)取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細胞,在轉(zhuǎn)染前4小時,更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。 

(7)轉(zhuǎn)染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1mL/瓶,置37℃作用4~6小時。 

(8)培養(yǎng):棄去培養(yǎng)液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養(yǎng)漂洗1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養(yǎng)2~3周。 

(9)檢測:逐日觀察,待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后,克隆分離,擴大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細胞株。

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