免疫組化染色方法大匯總
免疫組化的方法很多，新方法層出不窮，如二步法，要不斷更新，與時俱進(jìn)。雖然這些方法各有其特色，但總的來說，只要應(yīng)用恰當(dāng)均可獲得較為滿意的結(jié)果。方法 的選擇并不是影響免疫組化結(jié)果的主要因素。問題在于一個單位應(yīng)常規(guī)地、固定地使用一種方法，不宜交替使用不同的方法或經(jīng)常更換方法。一旦選定一種方法，應(yīng) 務(wù)必使其標(biāo)準(zhǔn)化，力圖使一抗、二抗、標(biāo)記試劑和底物的濃度、孵育時間和濃度、緩沖液的使用程序化、規(guī)范化。

一、SP法免疫組化染色
原理
鏈霉素抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉素中分離出的蛋白質(zhì)，穿透組織的能力比ABC、PAP復(fù)合物大，反應(yīng)速度快，它含有四個亞基，每個亞基都有與生物素 （Biotin）連接的部位，且二者間有*的親和力，SA的等電位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）為10，因此，SA幾乎不與組織中的 內(nèi)源性凝集樣物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，使用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶放大系統(tǒng)，即可產(chǎn)生低背景、高放大效果。S－P采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉素 抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。
基本染色方法
1、石蠟切片脫蠟至水；
2、3％H202室溫孵育5～10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；
3、蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行）；
4、5～10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小時或4℃；
5、PBS沖洗，5分鐘×3次；
6、滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1％BSA－PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
7、PBS沖洗，5分鐘×3次；
8、滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
9、PBS沖洗，5分鐘×3次；
10、顯色劑顯色（DAB或AEC）；
11、自來水充分沖洗，復(fù)染，封片。
附：冰凍切片免疫組化染色步驟
1、冰凍切片4～8um，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。
2、用3％過氧化氫孵育5～10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
3、PBS洗，5分鐘×2次。
4、下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。

二、卵白素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物法
原理
本方法是利用卵白素與生物素*的高度親和力這一生物學(xué)特性，先將生物素與酶結(jié)合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一 個復(fù)合物。具體步驟是：特異性抗體與組織中抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物。生物素化二抗再與特異性抗體反應(yīng)，然后加入ABC復(fù)合物，形成抗原＋特異性抗體＋ 生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復(fù)合物。zui后DAB顯色。
基本染色方法
1、切片常規(guī)脫蠟至水；
2、PBS洗5分鐘×2次；
3、0.3％甲醇－H2O2 30分鐘，37℃；
4、PBS洗5分鐘×2次；
5、正常動物血清20分鐘，37℃；
6、適當(dāng)稀釋的特異性抗體60分鐘，37℃；
7、PBS洗5分鐘×2次；
8、適當(dāng)稀釋的生物素標(biāo)記二抗，30分鐘，37℃；
9、PBS洗5分鐘×2次；
10、ABC復(fù)合物30－60分鐘，37℃；
11、PBS洗5分鐘×2次；
12、DAB顯色，鏡下控制；
13、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹膠封固。
附：微波－ABC法具體操作
1、常規(guī)脫蠟：二甲苯I、II各10分鐘，*I、II各10分鐘；
2、將切片置入裝有PBS液的染色缸中，微波修復(fù)1分鐘，冷卻置室溫；
3、滴加*抗體，微波修復(fù)1分鐘，孵育20分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
4、滴加第二抗體，微波修復(fù)1分鐘，孵育10分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
5、滴加第三抗體，微波修復(fù)1分鐘，孵育10分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
6、DAB顯色，（顯微鏡下控制）終止顯色，蒸餾水水沖洗。
7、蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，水洗，封片。

三、直接法
原理
用酶標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色的產(chǎn)物，沉積在抗原－抗體反應(yīng)的部位。
優(yōu)點(diǎn)：簡單、步驟少、省時、特異性強(qiáng)、非特異染色較輕；
缺點(diǎn)：敏感性差。
基本染色方法
1、切片常規(guī)脫蠟至水，PBS液，洗5分鐘；
2、1：20稀釋的正常血清處理切片20分鐘；
3、滴加適當(dāng)稀釋酶標(biāo)抗體，放在濕盒中，37℃，30～60分鐘；
4、PBS洗5分鐘×2次；
5、顯色，鏡下控制；
6、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹脂封固。

四、間接法
原理
先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)，再用抗特異性抗體的酶標(biāo)記抗體與結(jié)合在抗原上的一抗反應(yīng)。
優(yōu)點(diǎn)：方法簡便、敏感性較直接法高；
缺點(diǎn)：非特異染色較多。
基本染色方法
1、與直接法（1）～（2）相同；
2、滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體，4℃到第二天，或室溫30～60分鐘；
3、PBS洗5分鐘×2次；
4、滴加酶標(biāo)記抗體，室溫30分鐘；
5、后同直接法。

五、酶橋法
原理
用化學(xué)交聯(lián)法將酶與抗體分子連接，染色時在特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合之后，用橋抗體結(jié)合于其上，再將抗酶抗體結(jié)合于橋抗體上，zui后把酶結(jié)合在酶抗體上，經(jīng)過底物的呈色反應(yīng)而將抗原顯示出來。
優(yōu)點(diǎn)：提高了方法的敏感性，非特異染色較輕；
缺點(diǎn)：抗酶抗體必須是價、經(jīng)過高度純化，否則將降低敏感性。
基本染色方法
1、組織切片脫蠟至水，PBS洗5分鐘×2次；
2、用.。3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘；
3、充分水洗后，PBS洗5分鐘×2次；
4、1：20稀釋正常血清，室溫30分鐘；
5、PBS洗5分鐘×2次；
6、一抗，4℃，16～24小時；
7、PBS洗5分鐘×2次；
8、二抗，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
9、滴加抗酶抗體，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
10、用過氧化物酶溶液作用30分鐘，PBS充分洗凈；
11、在DAB－H2O2液中進(jìn)行顯色5～30分鐘，鏡下控制；
12、下同直接法。

六、過氧化物酶－過氧化物酶復(fù)合物法（PAP法）
原理
PAP法的基本原理與酶橋法相同，只是用酶和抗體制成的免疫復(fù)合物（PAP）代替了酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶，把兩個步驟合并為一個步驟。
優(yōu)點(diǎn)：敏感性比間接法高20倍；
缺點(diǎn)：理論上PAP是一種復(fù)合物，因其不是抗HRP抗體，不能與HRP結(jié)合，不會造成背景染色，但在實(shí)際工作中仍存在比較重的非特異性背景染色。
基本染色方法
1、組織切片脫蠟至水；
2、用0.3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘；
3、充分水洗后，PBS洗5分鐘×2次；
4、1：20稀釋正常血清，室溫30分鐘；
5、滴加一抗（兔），4℃中反應(yīng)13～24小時；
6、PBS洗5分鐘×2次；
7、加羊抗兔IgG，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
8、加PAP，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
9、用DAB顯色5～30分鐘；
10、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹膠封固。