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蛋白質濃度測定(雙縮脲法)實驗介紹

來源:上海嘉鵬   2016年04月22日 11:38  

實驗原理

測定蛋白質的定量方法有很多,目前常用的有凱氏定氮法;比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結合法;紫外分光光度法等
雙縮脲(Biuret)法:在堿性溶液中,雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物,這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CO—NH2),或與此相似的基團[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連,均可發(fā)生上述反應。蛋白質分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—),可發(fā)生雙縮脲反應,且呈色強度在一定濃度范圍內與肽鍵數量即與蛋白質含量成正比,可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標準液比較,經計算或查標準曲線即可求出血清總蛋白質含量。
實驗試劑

1.6mol/L氫氧化鈉溶液  
稱取氫氧化鈉(NaOH,優(yōu)級純)240g,用新鮮蒸餾水配制成1L,置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。
2.雙縮脲試劑  
稱取未失結晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g,溶于500m1新鮮蒸餾水中,加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,碘化鉀(KI)5.0g,待安全
溶解后,加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml,zui后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里,約穩(wěn)定6個月。
3.蛋白標準液 
可用商品血清蛋白標準液或定值質控血清為標準。亦可收集混合新鮮血清,用凱氏定氮法標定后,加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L),冰凍
保存。
實驗設備

恒溫水浴箱、722(721)分光光度計、吸管、試管、坐標紙
實驗步驟

1.   配制20g/L蛋白標準液  如蛋白標準液濃度為70g/L,則取此液2m1,加入新鮮蒸餾水5ml,混勻即成。
2.   按表操作
 
    加入物(ml)  空白管   1    2    3    4    5 測定管
20g/L蛋白標準液     ~    0.1    0.2   0.3       0.4       0.5        ~   
蒸餾水    0.5    0.4    0.3   0.2    0.1   ~      0.4
待測樣品液體   ~     ~    ~       ~     ~      ~        0.1
雙縮脲試劑     3.0   3.0     3.0       3.0        3.0       3.0       3.0     
相當血液蛋白質(g/L)      ~      20    40    60    80   100    
混勻,置37℃水浴10min(或25℃30min),用540nm波長比色,以空白管調零,讀取各管吸光度。
3.   標準曲線繪制
1—5為標準曲線管,測得吸光度后,以吸光度為縱坐標,蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。
4.   實驗結果
根據測定管吸光度,從標準曲線查找相對應的總蛋白濃度。 
 
注意事項

1.雙縮脲試劑中,加入酒石酸鉀鈉,Cu2 形成穩(wěn)定的絡合銅離子,以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比
      不低于3:1,加入KI作為抗氧化試劑。
2.雙縮脲試劑要封閉貯存.防止吸收空氣中的二氧化碳。
3.本法各種蛋白質的顯色程度基本相同,重復性好,幾乎不受溫度影響,*缺點是靈敏度較低。
4.黃疸血清.嚴重溶血對本法有明顯干擾。

5.本法繪制的標準曲線是一條通過原點的直線,在100g/L濃度之內呈良好的線性關系。

 

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