水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留酶聯(lián)免疫快速檢測方法的介紹

恩諾沙星(Enrofloxacin)是一種化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，是氟喹諾酮類藥物的代表產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖、臨床等各個(gè)領(lǐng)域。

該類藥物的耐藥性、殘留毒性以及不良反應(yīng)等的報(bào)道越來越多。

世界許多國家都針對該類藥物制定了動(dòng)物性食品中的zui大殘留*。

恩諾沙星的檢測一般采用色譜法作為確證性檢測方法；近年來快速篩選檢測的免疫分析方法引起越來越多的關(guān)注。

本研究旨在建立水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留的一步式ELISA快速檢測方法，以進(jìn)一步提高快速篩選檢測效率。

通過對傳統(tǒng)兩步式間接競爭ELISA競爭反應(yīng)模式、反應(yīng)時(shí)間、洗滌時(shí)間等主要因素的優(yōu)化改進(jìn)，建立了恩諾沙星一步式間接競爭ELISA檢測體系；利用不同的偶聯(lián)方法，建立并優(yōu)化了恩諾沙星酶標(biāo)抗體的合成方法，并以所制備的酶標(biāo)抗體為基礎(chǔ)建立了標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA檢測模式，并進(jìn)行了加標(biāo)水產(chǎn)樣品的檢測驗(yàn)證。

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

1.間接競爭ELISA中，采用平衡飽和模式，在競爭反應(yīng)中比較理想的競爭反應(yīng)物添加順序是酶標(biāo)二抗——待測抗原——特異性抗體，在適當(dāng)提高抗體濃度的前提下，可以將傳統(tǒng)兩步式簡化為一步式，檢測時(shí)間由總的4h以上，縮減到2h左右。

對水產(chǎn)樣品在10μg\kg～200μg\kg的加標(biāo)范圍內(nèi)，檢測的平均回收率可達(dá)到70%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15%。

此外，不同聚合度(PEG4000、6000、20000)、濃度(1%-9%)的聚乙二醇作為反應(yīng)加速劑對恩諾沙星間接競爭ELISA檢測的加速作用不顯著。

2.采用過碘酸鈉氧化法合成酶標(biāo)恩諾沙星抗體，根據(jù)紫外掃描結(jié)果計(jì)算出酶標(biāo)抗體的克分子比為1.6，酶結(jié)合量為1.2 mg\mL、酶結(jié)合率約為40%，均處于較好的質(zhì)量范圍內(nèi)；ELISA效價(jià)測定結(jié)果表明，酶標(biāo)抗體的效價(jià)達(dá)到10000×以上，工作效價(jià)在1000×左右，標(biāo)記前后抗體親和活性保持良好；所制備的酶標(biāo)恩諾沙星抗體對于主要同族藥物的交叉反應(yīng)率均低于1%。

3.采用N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)和硫酸化-琥珀酰胺-4-[N-馬來酰胺甲基]-環(huán)己烷-羧酸酯(Sulfo-SMCC)兩種異型雙功能交聯(lián)劑(可分別提供為6.8A和8.3A空間臂長)交聯(lián)制備酶標(biāo)抗體，所設(shè)定的HRP和IgG的用量、DTT作用的pH體系、交聯(lián)劑對蛋白的作用pH體系等影響因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，交聯(lián)劑對蛋白作用的pH體系對交聯(lián)結(jié)果的影響顯著；兩種交聯(lián)劑比較，空間臂較長的Sulfo-SMCC的性能略好。

4.利用高碘酸鈉法所制備的恩諾沙星酶標(biāo)記抗體，建立了標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA(Dc-ELISA)。

根據(jù)所用抗體種類及純化方式的不同，方法的zui低檢測限可以達(dá)到5μg\kg-10μg\kg，在設(shè)定的10μg\kg-40μg\kg的加標(biāo)濃度下，檢測的平均回收率可達(dá)到70%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以下。

5.標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA檢測方法應(yīng)用于在水產(chǎn)樣品檢測的HPLC驗(yàn)證結(jié)果表明，Dc-ELISA和HPLC方法呈現(xiàn)較好的相關(guān)性(R2可以達(dá)到0.95以上)，且一步式Dc-ELISA檢測方法所需時(shí)間僅為2h左右，樣品前處理純化的要求低，操作較為簡便，適合大量樣品的快速處理。

目前，針對食品中氟喹諾酮類殘留的免疫檢測方法的報(bào)道多集中在間接競爭ELISA檢測方面，對于直接競爭ELISA模式涉及的較少，標(biāo)記抗體型的直接競爭ELISA檢測研究，尚未見報(bào)道。

本研究合成了酶標(biāo)記恩諾沙星抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了具有良好靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度的一步式直接競爭ELISA檢測技術(shù)。

機(jī)臺名稱:水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留快速檢測儀

型號：CSY-E96S

水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留快速檢測儀儀器簡介：

CSY-E96S水產(chǎn)品藥物殘留檢測儀采用固相酶聯(lián)免疫吸附ELISA的原理,即酶聯(lián)免疫法；水產(chǎn)品藥物殘留檢測儀可定量快速檢測阿莫西林、孔雀石綠、磺胺類(總量)、重金屬、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、 紅霉素、氯霉素、土霉素、四環(huán)素、 磺胺類(總量)、喹乙醇、已烯雌酚等有毒有害物質(zhì)及抗生素殘留檢測。并且可以連接食品安全監(jiān)控系統(tǒng)。

水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留快速檢測儀技術(shù)參數(shù)：

☆波長范圍:300nm-1000nm

☆波長準(zhǔn)確度:±2nm

☆吸光度范圍: 0.000~4.000ABS

☆分辨率 :0.001Abs

☆穩(wěn)定性 : ±0.001A/hr

☆透射比重復(fù)性: ≤0.5%T

☆光源 : 進(jìn)口LED

☆樣品池 : 微孔板