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影響酶促反應(yīng)的因素—溫度、PH和抑制劑

來源:青島捷世康生物科技有限公司   2016年06月23日 08:29  

影響酶促反應(yīng)的因素—溫度、PH和抑制劑

目的要求

 通過本實驗了解pH、溫度、抑制劑對酶活力的影響。

實驗原理

 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現(xiàn)溫度效應(yīng)。酶促反應(yīng)開始時,反應(yīng)速度隨溫度升高增快。達(dá)到zui大反應(yīng)速度時的溫度稱為某種酶的zui適溫度。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì),當(dāng)達(dá)到zui適溫度后,繼續(xù)升高溫度,引起蛋白質(zhì)變性,酶促反應(yīng)速度反而逐步下降,以致*停止。

    酶的zui適溫度不是一個常熟,與作用時間長短有關(guān)。測定酶活性均在酶促反應(yīng)zui適溫度下進(jìn)行。大多數(shù)動物來源的酶zui適溫度為37~40℃,植物來源的酶zui適溫度為50~60℃。

    酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關(guān)系,通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才具有活性,酶活性zui高時的pH,稱為酶的zui適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低。

   酶的zui適pH不是一個特征物理常數(shù),對于同一個酶,其zui適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而又差異。

   在酶促反應(yīng)過程中,抑制劑對酶的抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制??赡嬉种朴懈鶕?jù)抑制劑和底物的關(guān)系分為三種類型:競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。

   在本試驗中,胰蛋白酶的zui適溫度為37℃,zui適pH值為8.1.胰蛋白酶的抑制劑為苯甲脒,其抑制方式為競爭性抑制。

試劑和器材

1、試劑

5%三氯醋酸溶液。1mmol/L苯甲脒溶液:稱取19.25g苯甲脒,用少量水溶解,定容至100mL。

1%酪蛋白溶液:取1g酪蛋白,加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL、水40mL,置60℃水浴加熱至溶解,放置室溫后,加水稀釋成100mL,并調(diào)至pH8.0.

0.1mol/L硼酸緩沖液:

A液,0.1mol/L硼酸(H3BO3):稱取6.18gH3BO3溶于1000mL水中。

B液,0.025mol/L硼砂(Na2B4O7·10H2O):

稱取9.54g硼砂(Na2B4O7·10H2O)溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸緩沖液:90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸緩沖液:70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸緩沖液:20mL A液+80mL B液

2、材料

胰蛋白酶溶液:50~200ug/mL,用0.1mol/L,pH8.0硼酸緩沖液配制。可用粗提的豬胰蛋白酶,用量根據(jù)實際測的比活值而定。

3、儀器

試管1.5cm×15cm(×19);移液管1mL(×7),2mL(×3),5mL(×5);量筒100mL(×1),恒溫水??;水浴90(0℃);白瓷板;膠頭滴管。

操作方法

1、溫度對酶活力的影響

取3支試管,空白管:先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,搖勻后,再加入0.2mL酶液,0.8mL蒸餾水,在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心,3000r/min,5分鐘,取上清液于280nm處測定各管的吸光值,并比較之。

2、pH對酶活力的影響

取3支試管,空白管:先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,搖勻后,再加入0.2mL酶液,0.8蒸餾水,在37℃保溫10min。

 將樣品管和空白管分別離心,3000r/min,5分鐘,取上清液于280nm處測定各管的吸光值,并比較之。

3、抑制劑對酶活力的影響

取3支試管,空白管:先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,搖勻后,再加入0.2mL酶液,0.8蒸餾水,在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心,3000r/min,5分鐘,取上清液于280nm處測定各管的吸光值。并比較之。

注意事項

1、由于胰蛋白酶活力不同,因此實驗應(yīng)隨時檢查反應(yīng)進(jìn)行情況。如反應(yīng)進(jìn)行的太快,應(yīng)適當(dāng)稀釋酶液;反之,則應(yīng)減少酶溶液的稀釋倍數(shù)。

2、注意不要在檢查反應(yīng)程度時使各管溶液混雜。

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