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還原糖和總糖含量的測(cè)定

來(lái)源:青島捷世康生物科技有限公司   2016年06月27日 08:39  

還原糖和總糖含量的測(cè)定

3,5-二硝基水楊酸比色法)

一、目的

掌握還原糖和總糖定量測(cè)定的基本原理,學(xué)習(xí)比色定糖法的基本操作。

二、原理

    還原糖和總糖含量的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類,單糖都是還原糖,雙糖和多糖不一定是還原糖,其中乳糖和麥芽糖是還原糖,蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同,可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái),對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定,在分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(還原糖以葡萄糖含量計(jì))。

   還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物,3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕色紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系,利用分光光度計(jì),在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值,查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算,便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí),每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水,所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。

三、實(shí)驗(yàn)用品

(一)、實(shí)驗(yàn)材料。

面粉

(二)、器皿

1、25mL刻度試管×11

2、大塑料離心管×1

3、100mL燒杯×1

4、100mL容量瓶×1

5、移液管:1mL×2,2mL×2

6、恒溫水浴鍋

7、沸水浴

8、離心機(jī)

9、電子天平

10、分光光度計(jì)

(三)、試劑

1、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液:準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖(預(yù)先在80℃烘至恒重),置于小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,定量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,以蒸餾水定容至刻度,搖勻,冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

2、3,5-二硝基水楊酸試劑:將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,在加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉,攪拌至溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,儲(chǔ)于棕色瓶中備用。

四、操作步驟

(一)、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取7支具有25mL刻度的刻度試管,編號(hào),加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑。將各試管搖勻,在沸水中加熱5min,取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫,再以蒸餾水定容到25mL刻度處,用橡皮塞塞住試管口,顛倒混勻。在540nm波長(zhǎng)下,用0號(hào)試管調(diào)零,分別讀取1~6試管的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo),葡萄糖質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(二)、樣品中還原糖含量的測(cè)定

1、樣品中還原糖的提取

    準(zhǔn)確稱取3g食用面粉,放在100mL的燒杯中,先以少量蒸餾水?dāng)噭?,置?0℃恒溫水浴中保溫20min,使還原糖浸出。然后轉(zhuǎn)入大塑料離心管中,4000r/min離心5min,上清液全部收集到100mL的容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,混勻,作為還原糖待測(cè)液。

2、總糖的水解和提取

    準(zhǔn)確稱取1g食用面粉,放入100mL三角瓶中,加15mL蒸餾水及10mL6mol/L HCI,置沸水浴中加熱水解30min(水解是否*可用碘-碘化鉀溶液檢查)。待三角瓶中的水解液冷卻后,加入1滴酚酞指示劑,用6mol/L,NaOH中和至微紅色,用蒸餾水定容在100mL容量瓶中,混勻。將定容后的水解液過(guò)濾,取濾液10mL,移入另一100mL容量瓶中定容,混勻,作為總糖待測(cè)液。

3、顯色和比色

    取4支25mL刻度試管,編號(hào)。分別加入待測(cè)夜和顯色劑,空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)試管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。

五、附注

1、離心比過(guò)濾易得上清液

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測(cè)定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行,一起顯色和比色。

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