免疫技術(shù)用熒光染料
在流式細(xì)胞計(jì)的應(yīng)用中,熒光色素是關(guān)鍵試劑,免疫熒光的檢測(cè),對(duì)試劑的要求尤其具有特殊性。
對(duì)熒光染料的要求1、染料必須在理想的激光光源的某一波長有強(qiáng)烈吸收;2、由于免疫熒光測(cè)定,信號(hào)的強(qiáng)度是主要限制因素,故要求染料應(yīng)有較高的量子效應(yīng)3、激發(fā)光和發(fā)射光之間要有較大的波長區(qū)別,以便使熒光能與激發(fā)光源所造成的背景區(qū)別開來4、便于同抗體和其他蛋白偶聯(lián),又不影響其熒光及抗體的特異性。
熒光染料 常見者見表。其中FITC已為國內(nèi)免疫界通用,此外不做介紹。當(dāng)前國內(nèi)常用的商品化的染料類是藻膽蛋白(Ohycobili protein)是來自光合青色細(xì)菌(photosyntheric cyanobacteria)和紅色藻類(Red algae)的自然熒光色素。其基本類型為:藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)、藻青蛋白(Phycocyanin)及別藻青蛋白(Allophycocyanin,APC),其分子結(jié)構(gòu)基本是幾個(gè)帶有開鏈四吡咯色基因的多肽混合物,很適合標(biāo)記抗體,它們有以下特點(diǎn):可以在廣泛的波長下有效地激發(fā);每個(gè)分子都帶有許多產(chǎn)生高激發(fā)系數(shù)的發(fā)光色基團(tuán);激發(fā)光、發(fā)射光易鑒別(Stokes位移大);易溶于水,發(fā)出的熒光不受pH影響,因而不易受生物因素影響而淬滅。這類熒光色素的代表是藻紅蛋白。目前,盡管應(yīng)用者較多,但其標(biāo)記困難及結(jié)合物易形成素脫落,保存時(shí)間短等缺點(diǎn),也影響其推廣,人們正在尋找新的熒光染料。為了測(cè)定細(xì)胞表面的多種標(biāo)記,還應(yīng)考慮免疫熒光染料反光源和這些顏料的相互配合的要求;1、兩種以上抗體同兩種以上色素交聯(lián),該色素可被單波長光激發(fā),并能通過特殊的發(fā)射光區(qū)別開;或用不同激發(fā)波長來激發(fā),發(fā)射光可通過光譜的差異、特殊發(fā)射光或發(fā)射時(shí)間不同來區(qū)別。2、結(jié)合抗體的色素不干擾抗體反應(yīng)的特異性,或同一實(shí)驗(yàn)中其他色素的特性。3、適用一步、二步、三步染色法,加適當(dāng)對(duì)照組能克服試劑間的干擾。
為了測(cè)定細(xì)胞表面的多種標(biāo)記,還應(yīng)考慮免疫熒光染料反光源和這些顏料的相互配合的要求;1、兩種以上抗體同兩種以上色素交聯(lián),該色素可被單波長光激發(fā),并能通過特殊的發(fā)射光區(qū)別開;或用不同激發(fā)波長來激發(fā),發(fā)射光可通過光譜的差異、特殊發(fā)射光或發(fā)射時(shí)間不同來區(qū)別。2、結(jié)合抗體的色素不干擾抗體反應(yīng)的特異性,或同一實(shí)驗(yàn)中其他色素的特性。3、適用一步、二步、三步染色法,加適當(dāng)對(duì)照組能克服試劑間的干擾。
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