*、的實(shí)驗(yàn)室分析方法搭配高精尖的科學(xué)儀器得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果必然是越來(lái)越。其實(shí)，要得到高質(zhì)量的檢測(cè)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)用試劑起著決定性意義。比如超純水就是起決定性作用的實(shí)驗(yàn)材料。

近幾年來(lái)，實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)有了很大的改進(jìn)。與此同時(shí)，檢測(cè)儀器設(shè)備也越來(lái)越精密、靈敏，這就要求所使用的試劑、稀釋劑和水要達(dá)到很高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在液相色譜法分析中，水質(zhì)的重要性到底如何呢?反相色譜的梯度洗脫zui能說(shuō)明問(wèn)題。因?yàn)榉聪嗌V中的多個(gè)色譜柱需要大量的水質(zhì)溶劑，而水質(zhì)溶劑的有機(jī)污染物會(huì)被色譜柱端部所吸附，在后續(xù)的梯度脫洗過(guò)程中會(huì)成為梯度脫洗的峰值。

在液相色譜法中，反相HPLC法是zui常采用的分離方法，但也面臨著一些可能影響數(shù)據(jù)質(zhì)量的風(fēng)險(xiǎn)。所以要zui大程度的避免交叉污染的可能性。這些交叉污染可能來(lái)自樣本中，也可能是實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿中的未被洗脫成分造成了在流動(dòng)相污染。另外，系統(tǒng)磨損產(chǎn)生的微粒、色譜柱上沉積的雜質(zhì)都有可能成為污染源。

根據(jù)McMaster的研究，在液相分析中zui困難的就是實(shí)驗(yàn)用超純水中雜質(zhì)帶來(lái)的污染。我們可以通過(guò)假峰數(shù)量是否增加、基線是否不平等現(xiàn)象來(lái)觀判斷其是否被污染。

有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員會(huì)在進(jìn)液相色譜之前，先對(duì)色譜用水進(jìn)行過(guò)濾，脫氣。但常常有一點(diǎn)還是被忽略，色譜用瓶裝超純水TOC含量可能高達(dá)幾百ppb。在調(diào)查有機(jī)物對(duì)HPLC的污染影響時(shí)進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。

在*個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在預(yù)置柱中對(duì)溶劑進(jìn)行濃縮，然后一步步的在分析柱中洗脫。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，利用梯度洗脫對(duì)藥品混合物進(jìn)行洗提分離。對(duì)混合物進(jìn)行了1310次的超純水添加，以便能夠?qū)τ米飨♂寗┑钠垦b超純水或新鮮超純水長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的使用結(jié)果給予評(píng)判。

圖1.用預(yù)置柱處理的HPLC瓶裝超純水和新鮮超純水進(jìn)行色譜分析得到的色譜圖(a)254nm和(b)214nm，后一種超純水得到的基線更加清晰、準(zhǔn)確。請(qǐng)注意a圖和b圖中的高度差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

*個(gè)實(shí)驗(yàn)期望得到的結(jié)論是：通過(guò)一級(jí)前置濃縮使得水中的各種有機(jī)污染物被前置柱端部所吸附。在洗脫時(shí)，有機(jī)物被色譜柱所洗脫，并表現(xiàn)為色譜圖中的峰值。圖2所示為HPLC用瓶裝水有機(jī)物污染的色譜圖。在圖1a(254nm)中、圖1b(214nm)中可以看到，所使用的HPLC瓶裝水帶來(lái)了多個(gè)峰值，zui大的峰值比前置濃縮處理的新鮮超純水的峰值要高15倍。

第二個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果在圖2中表示，是第50、290、530、770、1010和1310次添加超純水時(shí)的情況?；€漂移有著明顯的差異。雖然都是梯度脫洗，尤其是在低波長(zhǎng)的梯度脫洗中，基線漂移有著明顯的不同，可以觀察到是隨著時(shí)間的增加，HPLC瓶裝水中污染物在色譜柱上積累的結(jié)果(圖2a)。而使用新鮮的超純水得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2b)則看不到基線漂移。

圖2.使用HPLC瓶裝超純水處理藥品混合物溶劑的(254nm)色譜圖(a)和使用新鮮生產(chǎn)出來(lái)的超純水作為水質(zhì)溶劑的色譜圖(b)。作為有機(jī)溶劑使用的是Acetontril。

圖3a.通過(guò)HPLC用瓶裝水作為含水溶劑中的藥物混合物的色譜圖(214nm)。作為有機(jī)溶劑HPLC級(jí)乙腈中。

在對(duì)兩種不同水質(zhì)的試驗(yàn)對(duì)比中，使用HPLC瓶裝水能觀察到異常峰值，這也表明超純水導(dǎo)致流動(dòng)相交叉污染。當(dāng)分析樣本中未知成分時(shí)，非常容易將異常峰值誤判為樣本的組成成分之一，導(dǎo)致樣本量化分析出現(xiàn)錯(cuò)誤。在使用HPLC分析用瓶裝水時(shí)，色譜圖中*個(gè)因污染導(dǎo)致的異常峰值在254nm處(約5min后，加水編號(hào)770)和214nm處(約15min后，加水編號(hào)530)。

每一次的色譜梯度洗脫前，都要將色譜柱平衡到初始條件。一般情況下至少要用五倍到十倍的純水流動(dòng)相進(jìn)行平衡，一般情況下這至少是樣本添加容積的兩次方。在本文的兩個(gè)試驗(yàn)中，平衡所用純流動(dòng)相容積是樣本容積的200倍。經(jīng)過(guò)這種消耗相當(dāng)大的平衡后，流動(dòng)相中的微量水質(zhì)污染物在在色譜圖中帶來(lái)的干擾就可以忽略不計(jì)了。

當(dāng)您利用色譜進(jìn)行譜圖峰值判別或微量元素的檢測(cè)分析時(shí)，由流動(dòng)相交叉污染引起的背景峰值現(xiàn)象會(huì)降低方法的度、準(zhǔn)確性或靈敏性，對(duì)峰值數(shù)據(jù)的判斷產(chǎn)生影響。zui糟糕的情況下，會(huì)因基線的嚴(yán)重漂移和眾多的異常峰值使得整個(gè)色譜圖*無(wú)法使用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：新鮮超純水是HPLC法中zui合適的流動(dòng)相試劑。超純水中的有機(jī)雜質(zhì)的含量zui少(大約5ppb)，生產(chǎn)廠家不同，瓶裝水中有機(jī)污染物的含量也大不相同，但可利用在線TOC監(jiān)控技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。某些經(jīng)過(guò)測(cè)試的瓶裝超純水中有機(jī)碳總量TOC的含量高達(dá)777ppb。超純水的生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)廠的灌裝條件和包裝環(huán)境、瓶子和瓶蓋材料以及使用前瓶裝水在倉(cāng)庫(kù)中的存放時(shí)間長(zhǎng)短等因素都會(huì)影響超純水的質(zhì)量。

新生產(chǎn)的超純水總有機(jī)碳含量較低。逆向滲透可以有效去除80%~90%的有機(jī)污染物含量，逆向滲透后的電去離子又能夠有效的清除沉積的雜質(zhì)(無(wú)機(jī)、有機(jī)離子)。電去離子能夠*利用逆向滲透清除有機(jī)污染物，因?yàn)樗芘懦┻^(guò)逆向滲透膜的有機(jī)酸和胺?；钚蕴嘉接袡C(jī)物是第三種減少水質(zhì)有機(jī)物含量的方法。

第四種方法是紫外線光氧化法。分子經(jīng)兩種波長(zhǎng)(185nm和254nm)水銀紫外線燈照射超純水，產(chǎn)生羥基自由基，并生成氧。一般情況下，紫外線光氧化是整個(gè)超純水生產(chǎn)工藝中的zui后一步，經(jīng)這一步處理之后，超純水中的有機(jī)物含量基本達(dá)到技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的要求。通過(guò)上述不同超純水生產(chǎn)工藝的組合，可以在超純水生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定的、有機(jī)碳總量很低(約5ppb)的液相色譜用水。

結(jié)論

在C18預(yù)置柱中處理的HPLC用瓶裝超純水在隨后的梯度洗脫時(shí)會(huì)在色譜圖中產(chǎn)生多個(gè)異常峰值。所以可以得出結(jié)論：HPLC用的瓶裝超純水比新鮮的超純水含有更高的有機(jī)物含量。

在典型的反相液相色譜法梯度洗脫時(shí)，要用多于色譜柱容積多倍的弱極性水質(zhì)溶劑對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡，使其滿足初始條件。水質(zhì)溶劑中的有機(jī)雜質(zhì)會(huì)吸附在色譜柱的端部，會(huì)對(duì)色譜圖產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，出現(xiàn)基線漂移和異常峰，比如使用HPLC瓶裝超純水作為水質(zhì)溶劑時(shí)。

研究證明：新鮮的超純水有著較低的有機(jī)碳總量，保證了基線的均勻穩(wěn)定、也把異常峰出現(xiàn)概率減小到zui低，可以用作HPLC檢測(cè)的流動(dòng)相。