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2018
03-20

重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹
分離純化處于重組蛋白表達的下游處理（downstreamprocessing）階段，且與上游過程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標簽，是否進行分泌表達等。所以在對目的蛋白表達純化時，要統(tǒng)一考慮和整體設計，并充分考慮上游對下游的影響。同時，不同的表達系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達是否形成包涵體，目的蛋白表達定位（胞內、細胞膜內、周質空間和細胞外）由上表可知選擇將所表達的蛋白分泌到細胞外或周質空間可避免破碎細胞的步驟，而且細胞外和周質空間內的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細胞質內表達重
2018
03-20

包涵體復性注意事項和常見問題解析
包涵體復性注意事項1)zui適pH值范圍為8.0-9.0之間；2)溫度適宜選擇4℃；3)復性過程蛋白濃度不宜過大，一般為0.1-0.2mg/mL；4)復性時間一般為24-36小時；5)低分子化合物如L-Arg有助于增加復性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對蛋白質復性有促進作用；EDTA可以防止蛋白降解；6)首先要獲得較高純度的包涵體；7)包涵體溶解要*，一般應使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施；8)透
2018
03-19

原核表達系統(tǒng)蛋白表達問題解析
1、外源DNA片段成功插到載體里面（PCR鑒定），但無法表達蛋白一般判斷目的基因是否表達，首先要進行SDS-PAGE檢測。跑膠的時候一定要設對照：Marker，標準品陽性對照，以及空白載體(誘導)和重組載體(不誘導)2個陰性對照，再加上誘導不同時間的表達結果。跑SDS-PAGE的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在100ng左右；但是不能跟著做westernblot了。銀染的靈敏度在0.1～1ng；或是SyproRed，靈敏度高還可以繼續(xù)做Westernblot。在做過WesternBlot仍沒有檢
2018
03-19

鎳柱純化常見問題及分析
1:通過His標簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進？（1）如果純化的是上清，蛋白酶會部分降解目的蛋白，可通過加多種入蛋白酶抑制劑改進。（2）可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。（3）雜蛋白和目的蛋白結合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。2:鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事?(1)出現(xiàn)這樣的情況，主要是緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱
2018
03-16

多聚組氨酸標簽（His-tag）
固定化金屬離子親合層析(Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC)，簡稱金屬螯合親合層析，是一種新型的應用于原核蛋白純化的技術。該方法通過蛋白質表面的一些特殊的氨基酸，使之與金屬離子發(fā)生相互作用，從而對蛋白質進行親和純化。這些作用包括配價鍵結合、靜電吸附、共價鍵結合等，其中以6個組氨酸殘基組合的融合標簽（His-Tag）在原核蛋白表達中的應用zui為顯著。His-Tag可結合在目的蛋白的C末端或N末端，形成特殊的結構，以便于進行下一步的純化及檢
2018
03-16

蛋白質純化分離-材料的預處理
蛋白質在分子生物學中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實和根莖等為主；動物通常是選用實驗動物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發(fā)酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質都可以被外源表達出來，像原核蛋白表達就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達克隆基因，在原核表達體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設計合適的分離純化方案對于重組蛋白表達純化的下游實驗就顯得尤為重要。在
2018
03-15

蛋白純化方法—凝膠過濾色譜
基本原理凝膠過濾色譜蛋白純化法，又稱為空間排阻色譜，分子篩等。其原理是應用蛋白質分子量或分子形狀的差異來分離。當樣品從色譜柱的頂端向下運動時，大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒從而被迅速洗脫；而較小的蛋白質分子能夠進入凝膠顆粒中，且進入凝膠的蛋白在凝膠中保留時間也不同，分子量越大，流出時間就越早，zui終分離分子大小不同的蛋白質。通常，多數(shù)凝膠基質是化學交聯(lián)的聚合物分子制備的，交聯(lián)程度決定凝膠顆粒的孔徑。常用的色譜基質有：葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝
2018
03-15

免疫印跡（Western Blot）的基本原理、實驗步驟
WesternBlot原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。SDS-PAGE可對蛋白質樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質，并保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脫脂奶粉溶液）處理，封閉NC膜上的疏水結合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理NC膜——只有待研究的蛋白質才能與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，這
2018
03-14

Trizol法提取RNA實驗步驟
一、分離純化的基本原理研究基因的表達和調控時常常要從組織和細胞中分離和純化RNA。RNA質量的高低常常影響cDNA庫，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物學實驗的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。二、試劑和材料無水乙醇、氯fang、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、準備工作RNase酶非常穩(wěn)定，是導致RNA降解zui主要的物
2018
03-13

紫外分光光度法測定水中的NO3-—N
一、實驗目的1、鞏固紫外--可見分光光度法理論知識。2、掌握國產(chǎn)紫外分光光度計的基本構成及使用方法。3、掌握廢水中NO3-—N的紫外分光光度法測定方法二、概述1、方法原理利用硝酸根離子在220nm波長處的吸收而定量測定硝酸鹽氮。溶解的有機物在220nm處也會有吸收，而硝酸根離子在275nm處沒有吸收。因此，在275nm處作另一次測量，以校正硝酸鹽氮值。因此，硝酸根離子在220nm波長處的校正吸收值為△A=A220–2A275。2、干擾及消除溶解的有機物、表面活性劑、亞硝酸鹽、六價鉻、溴化物、碳酸
2018
03-13

冷原子吸收光譜法測定汞離子
一、實驗目的1、鞏固原子吸收光譜分析法理論知識。2、掌握測汞儀的基本構成及使用方法。3、掌握水中汞離子的冷原子吸收測定方法。二、概述1、方法原理儀器根據(jù)原子吸收光譜分析的原理即汞子對波長為253.7nrn的共振線上有強烈吸收作用制造的。吸收的大小與汞原子蒸汽的濃度的關系符合比耳定律。A＝lg1/T=lgI0/I=KCL式中：A一吸光度I一透射光強度C一汞蒸汽濃度T一透光率I0一入射光強度K一消光系數(shù)L一吸收光程的長度由于汞的沸點很低容易揮發(fā)，同時汞離子能定量地被亞錫離子還原為金屬汞，因而在常溫下
2018
03-12

免疫組化常用方法介紹
1、定義用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。2、原理根據(jù)抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，zui后通過呈色反應或熒光來顯示
2018
03-09

TA克隆原理及方法
一、PCR產(chǎn)物的T載體克?。ㄒ唬┲亟MT質粒的構建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分
2018
03-09

單抗制備流程
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫(yī)學與生物學基礎研究開創(chuàng)了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。一、細胞融合前準備(一)免疫方案選擇
2018
03-08

磷酸化蛋白質組學常用定量方法介紹
蛋白質的磷酸化修飾是生物體內重要的共價修飾方式之一。蛋白質的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程幾乎調節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉導、細胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過程在內的所有生命活動。目前已知有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導致的后果。在哺乳動物細胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特
2018
03-08

Fish探針標記方法大全
1、DNA的缺口平移法缺口平移是一種快速、簡便、成本相對較低以及生產(chǎn)高比活性均一標記DNA的方法。該技術可以制備序列特異的探針。當使用重組質粒探針時，雖然任何形式的雙鏈DNA都可以進行缺口平移標記。但通常使用限制性核酸內切酶將插入片段進行酶切和凝膠電泳純化后再進行缺口平移標記。此外，用這種探針進行雜交可產(chǎn)生較低的背景信號。2、DNA的隨機引物法這種方法是使用寡核苷酸引物和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段來標記DNApian段。這種方法可代替缺口平移產(chǎn)生均一的標記探針外，還在許多方面優(yōu)于缺
2018
03-07

GST融合蛋白純化常見問題解答
一、GST融合蛋白GST（谷胱甘肽轉移酶）能特異的與谷胱甘肽結合，表現(xiàn)為酶和底物的作用原理，利用這個原理，將GST做成標簽表達出融合蛋白，與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合，從而純化出目標蛋白，GST融合蛋白純化的特點有：純度高、純化條件溫和保持蛋白活性、促進蛋白可溶性表達等。二、GST蛋白結合效率太低1.可能原因：上樣流速太快，結合時間太短解決方案：GST親和層析是利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和結合，GST與
2018
03-07

SNP分型原理及方法介紹
1、技術原理首先通過PCR擴增含有SNP的基因[1]組片段，然后通過序列特異性引物實現(xiàn)單堿基延伸，隨后樣品分析物與芯片基質共結晶后在真空管中受瞬時納秒(10-9s)強激光激發(fā)。核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由于電場中離子飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的分子量，從而檢測出SNP位點信息。2、主要特點時間飛行質譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測準確率可達99.9%，除了準確性高、靈活性強、通量大、檢測周期短等優(yōu)勢外，zui有吸引力的應該還是它
2018
03-06

什么是抗體片段和抗體片段化
抗體片段化，就是用工具（蛋白酶及化學物質）將抗體分子切成特定大小的片段。Why？因為在實際運用時，抗體分子真的太大了！抗體分子的分子量一般為幾百道爾頓（例如IgM五聚體就更龐大了），分子直徑在10nm~15nm之間，而制備成抗體片段后，就呈現(xiàn)出各自的優(yōu)勢?？贵w片段特性及功能抗體片段化后，因去掉了某些功能結構域以及分子量的改變，具有與全長抗體不同的特性：1、顯著降低Fc的非特異性結合；2、沉淀和免疫印跡中可降低抗體與proteinA、proteinG的結合；3、更好的組織滲透性，免疫組化實驗中染色
2018
03-06

流式細胞術實驗中的常見問題及其解決方法
本文匯總了流式細胞術實驗中常見問題（無法標記、PE抗體檢測不到但FITC可檢測到、非特異性染色、熒光強度弱、散射光信號異常、結果與預期相反等），并給出了各種可能的原因以及對應的解決方法，希望對您實驗有所幫助。一、細胞無法標記1．確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲。2．確保商品化抗體沒有超過有效期。3．確保已正確加入足量的抗體。4．確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。5．確保二抗是好的，也就是說二抗曾經(jīng)能與另外的一抗成功結合。6．確保使用了正確的二抗，就是說二抗

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