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【技術(shù)】教你如何達(dá)到提取RNA的最高境界！2021/08/31
免除RNase的困擾RNA分子異常脆弱，很容易就會被無處不在的RNase降解，輕輕松松的就讓實驗人員的種種努力付之東流。尤其是當(dāng)樣品極其稀少且珍貴時，RNA的降解更是讓各位小伙伴們想自掛東南枝。因而RNase可謂是RNA提取的大敵，那么為了保護好RNA分子，就必須把RNase給KO掉。當(dāng)然針對外來的敵人，只要注意這三個小細(xì)節(jié)，那么絕對可以克敵制勝。（1）嚴(yán)格戴好口罩、手套。手指和呼吸是外源性RNase的主要來源，所以在提取RNA時，一定全副武裝起來，才好擒獲RNA分子。（2）實驗中所涉及的離心管
RNA Trizol 抽提步驟2021/08/30
PCR、qRT-PCR最最初始，都離不開RNA的抽提，RNA質(zhì)量的好壞，直接影響到后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及PCR等過程。很多時候，小伙伴們明明跟著Trizol步驟一步一步來的，謹(jǐn)小慎微，不敢懈怠，但就是RNA抽提不過關(guān)。其實Trizol抽提RNA是個細(xì)活兒，小伙伴們根據(jù)自身的實戰(zhàn)經(jīng)驗，做一下優(yōu)化很有必要~Trizol標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟（打勾勾的自然是要注意的地方）：1、將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10min，使得核蛋白與核酸*分離。?樣品中如含有較多的蛋白質(zhì)、多糖、脂肪或其他細(xì)胞外基質(zhì)，可以12,000rp
【干貨】RNA抽提原理和流程2021/08/30
現(xiàn)在我們所熟知的TRIzol是LifeTechnologies公司的商品名，而同樣的試劑在PiotrChomczynski創(chuàng)辦的MRC公司則被命名為RNAzol（據(jù)PiotrChomczynski透露，他們已經(jīng)將RNAzol改進，使抽提得到的RNA無基因組DNA殘留）。事實上，這種RNA抽提的方法應(yīng)該叫做“異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”。TRIzol作用原理：在勻質(zhì)化或溶解樣品中，TRIzol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后，裂解液分離成水相和有機相。RNA存
【RNA提取】RNA抽提的三大紀(jì)律八項注意！2021/08/30
今天我們談一談RNA抽提的問題。為了方便大家記憶，總結(jié)出了“三大紀(jì)律八項注意”。紀(jì)律一：無外源酶的污染。外源酶會造成RNA的降解，造成RNA得率太低，或者*失敗。而外源酶又是無處不在的。這就要求注意以下三點：注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。手指和呼吸時重要的外源酶的來源。所以童鞋們做RNA抽提的時候，還是要全副武裝起來。這對自己也是一種保護措施。注意二：實驗所涉及的離心管，槍頭，移液器，實驗臺面等要*處理。離心管和槍頭要用DEPC處理過，單純的消毒滅菌可不行呀。移液器和實驗臺面等要用75%的酒精擦過
基因研究做引物設(shè)計，一定要知道轉(zhuǎn)錄本能干什么！2021/08/30
我們平常通過數(shù)據(jù)庫查找某個基因的相關(guān)信息時，會發(fā)現(xiàn)該基因有多個轉(zhuǎn)錄本。為什么一個基因可以有多個轉(zhuǎn)錄本呢？轉(zhuǎn)錄本能干什么？轉(zhuǎn)錄本其實就是基因通過轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可供編碼蛋白質(zhì)的成熟的mRNA。一個基因有可能有多個轉(zhuǎn)錄本，原因是由于不同的剪接方式造成的。我們都知道，基因轉(zhuǎn)錄之后，首先是形成前體mRNA，通過剪切內(nèi)含子連接外顯子，5’端加帽及3’端加尾之后形成成熟的mRNA。但是在剪切的過程中可能會剪切掉外顯子，也有可能保留部分內(nèi)含子，這樣就形成了多種mRNA即多個轉(zhuǎn)錄本。舉個栗子：這是一個三個外
RNA反轉(zhuǎn)錄又失敗了？填坑還得看這六大要素！2021/08/30
老話說的好，萬事開頭難。而這話在RT-PCR中則較為體現(xiàn)出來，其開頭的第一步——將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，表面上看似簡單，實際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個坑，就會讓斗志高昂的實驗汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。顯然，RNA的反轉(zhuǎn)錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰(zhàn)、屢戰(zhàn)屢敗，就是因為忽略了以下這6個要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里看著悲催的實驗結(jié)果唉聲嘆氣呢？1.RTPrimer的*通常RTprimer可分為三類：oligodT，隨機引物以及基因特異性引物。Oligod
RNA轉(zhuǎn)錄的實驗方法選擇和步驟2021/08/27
正規(guī)化管理的實驗室都會給新人進行相關(guān)技能體系的培訓(xùn)，但是被老板散養(yǎng)的研究僧或者無奈從0開始做科研的臨床醫(yī)生也不在少數(shù)。他們在初始接觸分子實驗時，手持《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)》這本寶典，很容易被五花繚亂的實驗方法亂了陣腳······連轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據(jù)自己的實際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個問題而不是一口吃成一個大胖子，然后關(guān)鍵是明確實驗對象和實驗?zāi)康摹Ｅe個栗子，現(xiàn)在手頭上的樣本是某個類型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測這些樣本與正常組織樣本
新型RNAi載體——saiRNA，更為安全的高效RNA干擾載體！2021/08/27
RNAi技術(shù)的前世今生造物真的很神奇。生物體有很多機會被來自病毒、細(xì)菌等外源性基因隨機整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)。但宿主會說，“你有張良計我有過墻梯”，這個過墻梯就是RNAi：宿主細(xì)胞會對這些外源性基因dsRNA隨即產(chǎn)生反應(yīng)，被核酸內(nèi)切酶Dicer切割成小片段RNA（即siRNA）。siRNA再與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA進行特異性結(jié)合并將其切割，使得mRNA降解。然后siRNA還會
【RNAi與siRNA技術(shù)】基因敲除鼠的實驗建議2021/08/27
如果是在做動物實驗，而且是基因敲除鼠的實驗，那么就會做大批量的小鼠基因型鑒定試驗，來確定自己小鼠的基因型，然而，再做實驗的過程中往往會出現(xiàn)一些意想不到的結(jié)果，在這里為大家提一點點小建議。提取DNA1、組織提取DNA剪下老鼠0.5-1.2cm尾巴或者耳朵或者稱取20mg組織樣本，將樣本剪碎放在1.5ml的EP管中。2、在每個EP管中加入275微升的裂解液（我們實驗室使用的是promega的試劑盒）將加入裂解液的組織放在55攝氏度的水浴箱中過夜（16—18h）裂解*的標(biāo)志是組織*溶解。3、第二天振蕩
一篇就夠了，帶你了解高通量測序！2021/08/27
說到近十年來發(fā)展最迅猛的生物技術(shù)，首先想到了高通量測序,我們研究基因組學(xué)都離不開它。目前，高通量測序已經(jīng)深入到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，不僅有力地推動了基礎(chǔ)研究的發(fā)展，也在逐漸征服臨床應(yīng)用。所謂的高通量測序技術(shù)，又名大規(guī)模平行測序，是將DNA（或者cDNA）隨機片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫中數(shù)以萬計的克隆(colony)進行延伸反應(yīng)，檢測對應(yīng)的信號，最終獲取序列信息。與Sanger法為代表的傳統(tǒng)測序法相比，高通量測序技術(shù)在處理大規(guī)模樣品時具有顯著的優(yōu)勢，又快（兩天）又多（數(shù)百萬克?。蔀?
避免踩坑，注意別踩DNA測序里的大坑！2021/08/27
DNA測序技術(shù)自從發(fā)明以來，作為一種重要的分子生物學(xué)手段，正在科研和臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用。下面，介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個前車之鑒吧。坑一：信號衰減/中斷測序信號衰減和中斷，是測序過程中的常見問題，原因多種多樣：模板中含有重復(fù)序列，模板中含有高級結(jié)構(gòu)，模板中GC含量過高等，都會使得測序信號衰減和中斷。另外，引物的質(zhì)量不好，試劑失活了，都會造成這種問題。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來進行測序，然后通過序列拼接獲得全長。有時候就象做拼圖游戲。大家havefun吧。這里，
DNA 甲基化測序常用方法2021/08/26
隨著高通量測序技術(shù)（NGS）技術(shù)的發(fā)展，使我們能夠從全基因組水平來分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發(fā)現(xiàn)很多傳統(tǒng)的基因組學(xué)研究所不能發(fā)現(xiàn)的東西，這就是所謂的“DNA甲基化測序”！DNA甲基化測序方法按原理可以分成三大類：1、重亞硫酸鹽測序；2、基于限制性內(nèi)切酶的測序；3、靶向富集甲基化位點測序；基于以上原理又有數(shù)種不同的測序方法，下面，就介紹10種DNA甲基化測序的常用方法：1)重亞硫酸鹽測序該方法可以從單個堿基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重?zé)熈蛩猁}對基因組DNA進行處
電泳中的異?，F(xiàn)象及其原因分析2021/08/26
跑電泳是分子生物學(xué)實驗的一項基本技術(shù)。只要做分子生物學(xué)方面的實驗，可能或多或少，或早或晚都要跑跑電泳。有時候，跑電泳跑著跑著也會出現(xiàn)一些奇奇怪怪的現(xiàn)象。下面，談一談跑電泳的過程中可能會發(fā)生的異?，F(xiàn)象，可能的原因，以及處理的方法。1.加樣孔有熒光下圖的紅框部分就是一個典型的加樣孔有熒光的例子。發(fā)生這種現(xiàn)象可能的原因如下：首先一定有DNA的滯留，其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會被EB染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA(50kb)，如果
【DNA 電泳】教你做果凍：瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧分享2021/08/26
果凍晶瑩剔透，口感QQ的，其實果凍的原料瓊脂糖，也是我們平時用來跑電泳的材料，瓊脂糖凝膠電泳實驗常用以DNA切膠回收，DNA分離和用于佐證DNA是否重組、質(zhì)粒等是否切開。今天我們就來聊聊瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小細(xì)節(jié)。第一步：膠液的制備稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱，直到瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液?？傄后w量不宜超過錐瓶的50%容量。否則會溢出來的。還要擦洗微波爐。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的
【教程】構(gòu)建載體其實一點也不難！2021/08/26
我們在研究基因的功能時，逃脫不掉的就是為了我們的實驗?zāi)康?，可能需要?gòu)建各種載體，比如表達(dá)載體，克隆載體，基因打靶載體等等。很多人在構(gòu)建載體的時候都感覺很困難，特別是對于一個剛進入實驗室的新人來說那更是難上加難，*摸不著頭腦。那是因為其實構(gòu)建載體是一個不小的工作量，需要經(jīng)歷很多的過程，比如首先我們需要設(shè)計引物引入酶切位點，接下來還需要經(jīng)歷酶切酶連等過程，只要其中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，那最終都會導(dǎo)致實驗失敗。構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計引物引入酶切位點，一旦引物設(shè)計好，那接下來就非常簡單了，今天重點就
表達(dá)融合蛋白時，如何把兩個基因拼接起來？2021/08/26
A君：我要表達(dá)一個ras加GFP融合蛋白，怎么設(shè)計引物？安培君：你的GFP標(biāo)簽蛋白在載體里還是要你自己插進去？A君：是我自己插進去。安培君：你打算怎樣融合？A君：是不是這樣？酶切A基因，酶切質(zhì)粒，把A先插入載體，篩選出克隆，然后酶切B基因，用不同的酶酶切質(zhì)粒，將B基因插入含A的載體。安培君：No,何必這么復(fù)雜，SOEPCR吧！A君：什么是SOEPCR？SOEPCR是一種通過寡聚合甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板進行PCR擴增，從而獲得目的DNA基因片段的方法。SOEPCR可簡單地憑借互補引
教你如何做分子構(gòu)建，從此邁向科研達(dá)人！2021/08/25
做過分子實驗的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很苦逼的，1個月做100個克隆那都是小case，沒點看家的本事怎么行。如果再遇到比較稀有的基因，周旋個把月，那也是家常便飯。下面就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗，從此邁向科研達(dá)人！1.準(zhǔn)備工作俗話說：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推薦兩個工具，一個是oligo軟件，常用于引物設(shè)計和酶切位點分析；另一個是DNAstar軟件，工具*大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作DNA和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。2
學(xué)學(xué)序列拼接，想節(jié)省費用的千萬別錯過！2021/08/25
相信大家PCR之后一般要進行測序以保證擴增序列的正確性吧？由于測序能力的限制，目前好的公司也只能保證一個反應(yīng)800bp測準(zhǔn)。如果大家的克隆片斷大于1k，那么勢必要同時測兩個反應(yīng)，然后將兩個反應(yīng)得到的序列利用其相互重疊的部分進行拼接，這樣才能得到完整的PCR產(chǎn)物序列。怎樣拼接呢？多付點錢，讓公司幫你拼接？實在沒有這個余錢了~好吧，還是自己老老實實學(xué)拼接吧！悲催的童鞋們走過路過不要錯過......首先下載并安裝ContigExpress，打開軟件：
你真的了解 TA 克隆嗎？2021/08/25
首先，TA克隆是用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序。原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點中。那么在你做TA克隆時，需要準(zhǔn)備的前期工作是什么呢？1、設(shè)計引物P出你的目的基因不管你是手動設(shè)計還是軟件設(shè)計或是直接引用別人已經(jīng)發(fā)表文章用到的引物，只要能P出來目的片段就行，在PCR的結(jié)果中需要注重P出來的濃度，要達(dá)到濃度高的要求一方面是在前期的樣本準(zhǔn)備本身就得到高濃
上圖！教你秒懂重組 DNA 技術(shù)常用工具酶！2021/08/25
1分子剪刀——限制性內(nèi)切酶：作用：識別特異序列，切割DNA限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例：2膠水——DNA連接酶作用：跟限制性內(nèi)切酶對著干，催化DNA中相鄰核苷酸間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口縫合，連接DNA片段。無論是雙股或是單股DNA的黏合，DNA黏合酶都可以借由形成磷酸雙脂鍵將DNA在3'端的尾端與5'端的前端連在一起。3DNA聚合酶就像玩拼圖能手，DNA聚合酶用于DNA復(fù)制，連接兩條DNA單鏈形成一條DNA雙鏈，作用于堿基對間的氫鍵。DNA聚合酶主要應(yīng)用于：a.合成雙鏈
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