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藥品質(zhì)量檢測方法之質(zhì)譜法
2022年08月29日 15:57:40 來源：化工儀器網(wǎng) 點擊量：5875

近期，化工儀器網(wǎng)編輯整理了一系列藥品質(zhì)量檢測方法，本文將從儀器的一般要求、測定方法兩個方面為大家介紹藥品質(zhì)量檢測方法之質(zhì)譜法。

　　【化工儀器網(wǎng) 行業(yè)百態(tài)】藥品是一種特殊的商品，它可以用于人疾病的預(yù)防、治療以及診斷，藥品的質(zhì)量關(guān)系著人民群眾的生命健康。藥品質(zhì)量檢測是指借助一定檢測手段，對藥物進行鑒別、含量測定以及進行有效性、均一性、純度要求與安全檢查，并將結(jié)果與規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較，最終判斷被測藥物是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一種質(zhì)量控制活動。
 
　　根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》，藥品檢測方法主要包括儀器分析方法、物理常數(shù)測定方法、生物檢查法、分子生物學(xué)檢查法、其他測定方法等。近期，化工儀器網(wǎng)編輯整理了一系列藥品質(zhì)量檢測方法，本文將從儀器的一般要求、測定方法兩個方面為大家介紹藥品質(zhì)量檢測方法之質(zhì)譜法。
 
　　質(zhì)譜法是使待測化合物產(chǎn)生氣態(tài)離子，再按質(zhì)荷比(m/z)將離子分離、檢測的分析方法，檢測限可達 10-15~10-12mol 數(shù)量級。質(zhì)譜法可提供分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的信息，定量測定可采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法。
 
　　一、儀器的一般要求
 
　　質(zhì)譜儀的主要組成如圖所示。在由泵維持的約 10-3~10-6Pa 真空狀態(tài)下，離子源產(chǎn)生的各種正離子(或負離子)，經(jīng)加速，進入質(zhì)量分析器分離，再由檢測器檢測。計算機系統(tǒng)用于控制儀器，記錄、處理并儲存數(shù)據(jù)，當(dāng)配有標(biāo)準(zhǔn)譜庫軟件時，計算機系統(tǒng)可以將測得的質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中圖譜比較，獲得可能化合物的組成和結(jié)構(gòu)信息。

 


 

　　1、進樣系統(tǒng)
 
　　樣品導(dǎo)入不影響質(zhì)譜儀的真空度。進樣方式的選擇取決于樣品的性質(zhì)、純度及所采用的離子化方式。
 
　　①直接進樣
 
　　室溫常壓下，氣態(tài)或液態(tài)化合物的中性分子通過可控漏孔系統(tǒng)，進入離子源。吸附在固體上或溶解在液體中的揮發(fā)性待測化合物可采用頂空分析法提取和富集，程序升溫解吸附，再經(jīng)毛細管導(dǎo)入質(zhì)譜儀。
 
　　揮發(fā)性固體樣品可置于進樣桿頂端，在接近離子源的高真空狀態(tài)下加熱、氣化。采用解吸離子化技術(shù)，可以使熱不穩(wěn)定的、難揮發(fā)的樣品在氣化的同時離子化。
 
　　多種分離技術(shù)已實現(xiàn)了與質(zhì)譜的聯(lián)用。經(jīng)分離后的各種待測成分可以通過適當(dāng)?shù)慕涌趯?dǎo)入質(zhì)譜儀分析。
 
　　②氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）
 
　　在使用毛細管氣相色譜柱及高容量質(zhì)譜真空泵的情況下，色譜流出物可直接引入質(zhì)譜儀。
 
　　③液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）
 
　　使待測化合物從色譜流出物中分離、形成適合于質(zhì)譜分析的氣態(tài)分子或離子需要特殊的接口。為減少污染，避免化學(xué)噪聲和電離抑制，流動相中所含的緩沖鹽或添加劑通常應(yīng)具有揮發(fā)性，且用量也有一定的限制。
 
　　A.粒子束接口：液相色譜的流出物在去溶劑室霧化、脫溶劑后，僅待測化合物的中性分子被引入質(zhì)譜離子源。粒子束接口適用于分子質(zhì)量小于 1000 道爾頓的弱極性、熱穩(wěn)定化合物的分析，測得的質(zhì)譜可以由電子轟擊離子化或化學(xué)離子化產(chǎn)生。電子轟擊離子化質(zhì)譜常含有豐富的結(jié)構(gòu)信息。
 
　　B.移動帶接口：流速為 0.5~l.5ml/min 的液相色譜流出物，均勻地滴加在移動帶上，蒸發(fā)、除去溶劑后，待測化合物被引入質(zhì)譜離子源。移動帶接口不適宜于極性大或熱不穩(wěn)定化合物的分析，測得的質(zhì)譜可以由電子轟擊離子化或化學(xué)離子化或快原子轟擊離子化產(chǎn)生。
 
　　C.大氣壓離子化接口：是目前液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用廣泛采用的接口技術(shù)。由于兼具離子化功能，這些接口將在離子源部分介紹。
 
　　④超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（SFC-MS）
 
　　超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用主要采用大氣壓化學(xué)離子化或電噴霧離子化接口。色譜流出物通過一個位于柱子和離子源之間的加熱限流器轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)，進入質(zhì)譜儀分析。
 
　　⑤毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）
 
　　幾乎所有的毛細管電泳操作模式均可與質(zhì)譜聯(lián)用。選擇接口時，應(yīng)注意毛細管電泳的低流速特點并使用揮發(fā)性緩沖液。電噴霧離子化是毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用最常用的接口技術(shù)。
 
　　2、離子源
 
　　根據(jù)待測化合物的性質(zhì)及擬獲取的信息類型，可以選用不同的離子源。
 
　　①電子轟擊離子化（EI）
 
　　處于離子源的氣態(tài)待測化合物分子，受到一束能量(通常是 70eV)大于其電離能的電子轟擊而離子化。質(zhì)譜中往往含有待測化合物的分子離子及具有待測化合物結(jié)構(gòu)特征的碎片離子。電子轟擊離子化適用于熱穩(wěn)定的、易揮發(fā)化合物的離子化，是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用最常用的離子化方式。當(dāng)采用粒子束或移動帶等接口時，電子轟擊離子化也可用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用。
 
　　②化學(xué)離子化（CI）
 
　　離子源中的試劑氣分子(如甲烷、異丁烷和氨氣)受高能電子轟擊而離子化，進一步發(fā)生離子-分子反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的試劑氣離子，再使待測化合物離子化?；瘜W(xué)離子化可產(chǎn)生待測化合物(M)的(M+H)+或(M-H)-特征離子或待測化合物與試劑氣分子產(chǎn)生的加合離子。與電子轟擊離子化質(zhì)譜相比，化學(xué)離子化質(zhì)譜中碎片離子較少，適宜于采用電子轟擊離子化無法得到分子質(zhì)量信息的熱穩(wěn)定的、易揮發(fā)化合物分析。
 
　　③快原子轟擊（FAB）或快離子轟擊離子化（LSIMS）
 
　　高能中性原子(如氬氣)或高能銫離子，使置于金屬表面、分散于惰性黏稠基質(zhì)(如甘油)中的待測化合物離子化，產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-特征離子或待測化合物與基質(zhì)分子的加合離子?？煸愚Z擊或快離子轟擊離子化非常適合于各種極性的、熱不穩(wěn)定化合物的分子質(zhì)量測定及結(jié)構(gòu)表征，廣泛應(yīng)用于分子質(zhì)量高達 10 000 道爾頓的肽、抗生素、核苷酸、脂質(zhì)、有機金屬化合物及表面活性劑的分析。
 
　　快原子轟擊或快離子轟擊離子化用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用時，需在色譜流動相中添加 1%~10%的甘油，且必須保持很低流速(1~10µl/min)。
 
　　④基質(zhì)輔助激光解吸離子化（MALDI）
 
　　將溶于適當(dāng)基質(zhì)中的供試品涂布于金屬靶上，用高強度的紫外或紅外脈沖激光照射，使待測化合物離子化?；|(zhì)輔助激光解吸離子化主要用于分子質(zhì)量在 100000 道爾頓以上的生物大分子分析，適宜與飛行時間分析器結(jié)合使用。
 
　　⑤電噴霧離子化（ESI）
 
　　離子化在大氣壓下進行。待測溶液(如液相色譜流出物)通過一終端加有幾千伏高壓的毛細管進入離子源，氣體輔助霧化，產(chǎn)生的微小液滴去溶劑，形成單電荷或多電荷的氣態(tài)離子。這些離子再經(jīng)逐步減壓區(qū)域，從大氣壓狀態(tài)傳送到質(zhì)譜儀的高真空中。電噴霧離子化可在 1µl/min~1ml/min 流速下進行，適合極性化合物和分子質(zhì)量高達 100000 道爾頓的生物大分子研究，是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用最成功的接口技術(shù)。
 
　　⑥大氣壓化學(xué)離子化（APCI）
 
　　原理與化學(xué)離子化相同，但離子化在大氣壓下進行。流動相在熱及氮氣流的作用下霧化成氣態(tài)，經(jīng)由帶有幾千伏高壓的放電電極時離子化，產(chǎn)生的試劑氣離子與待測化合物分子發(fā)生離子-分子反應(yīng)，形成單電荷離子，正離子通常是(M+H)+，負離子則是(M-H)-。大氣壓化學(xué)離子化能在流速高達 2ml/min 下進行，常用于分析分子質(zhì)量小于 1500 道爾頓的小分子或弱極性化合物，主要產(chǎn)生的是(M+H)+或(M-H)-離子，很少有碎片離子，是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的重要接口之一。
 
　　⑦大氣壓光離子化（APPI）
 
　　與大氣壓化學(xué)離子化不同，大氣壓光離子化是利用光子使氣相分子離子化。該離子化源主要用于非極性物質(zhì)的分析，是電噴霧離子化、大氣壓化學(xué)離子化的一種補充。大氣壓光離子化對于試驗條件比較敏感，摻雜劑、溶劑及緩沖溶液的組成等均會對測定的選擇性、靈敏度產(chǎn)生較大影響。
 
　　3、質(zhì)量分析器
 
　　質(zhì)量范圍、分辨率是質(zhì)量分析器的兩個主要性能指標(biāo)。質(zhì)量范圍指質(zhì)量分析器所能測定的質(zhì)荷比的范圍；分辨率表示質(zhì)量分析器分辨相鄰的、質(zhì)量差異很小的峰的能力。雖然不同類型的質(zhì)量分析器對分辨率的具體定義存在差異，高分辨質(zhì)譜儀通常指其質(zhì)量分析器的分辨率大于 104。
 
　　①扇形磁場分析器
 
　　離子源中產(chǎn)生的離子經(jīng)加速電壓(V)加速，聚焦進入扇形磁場(磁場強度 B)。在磁場的作用下，不同質(zhì)荷比的離子發(fā)生偏轉(zhuǎn)，按各自的曲率半徑(r)運動：
 
　　m/z=B2r2/2V
 
　　改變磁場強度，可以使不同質(zhì)荷比的離子具有相同的運動曲率半徑(r)，進而通過狹縫出口，達到檢測器。
 
　　扇形磁場分析器可以檢測分子質(zhì)量高達15000道爾頓的單電荷離子。當(dāng)與靜電場分析器結(jié)合、構(gòu)成雙聚焦扇形磁場分析器時，分辨率可達到105。
 
　　②四極桿分析器
 
　　分析器由四根平行排列的金屬桿狀電極組成。直流電壓(DC)和射頻電壓(RF)作用于電極上，形成了高頻振蕩電場(四極場)。在特定的直流電壓和射頻電壓條件下，一定質(zhì)荷比的離子可以穩(wěn)定地穿過四極場，到達檢測器。改變直流電壓和射頻電壓大小，但維持它們的比值恒定，可以實現(xiàn)質(zhì)譜掃描。
 
　　四極桿分析器可檢測的分子質(zhì)量上限通常是4000道爾頓，分辨率約為103。
 
　　③離子阱分析器
 
　　四極離子阱(QIT)由兩個端蓋電極和位于它們之間的環(huán)電極組成。端蓋電極處在地電位，而環(huán)電極上施加射頻電壓(RF)，以形成三維四極場。選擇適當(dāng)?shù)纳漕l電壓，四極場可以儲存質(zhì)荷比大于某特定值的所有離子。采用“質(zhì)量選擇不穩(wěn)定性”模式，提高射頻電壓值，可以將離子按質(zhì)量從高到低依次射出離子阱。揮發(fā)性待測化合物的離子化和質(zhì)量分析可以在同一四極場內(nèi)完成。通過設(shè)定時間序列，單個四極離子阱可以實現(xiàn)多級質(zhì)譜(MSn)的功能。
 
　　線性離子阱(LIT)是二維四極離子阱，結(jié)構(gòu)上等同于四極質(zhì)量分析器，但操作模式與三維離子阱相似。四極線性離子阱具有更好的離子儲存效率和儲存容量，可改善的離子噴射效率及更快的掃描速度和較高的檢測靈敏度。
 
　　離子阱分析器與四極桿分析器具有相近的質(zhì)量上限及分辨率。
 
　　④飛行時間分析器（TOF）
 
　　具有相同動能、不同質(zhì)量的離子，因飛行速度不同而實現(xiàn)分離。當(dāng)飛行距離一定時，離子飛行需要的時間與質(zhì)荷比的平方根成正比，質(zhì)量小的離子在較短時間到達檢測器。為了測定飛行時間，將離子以不連續(xù)的組引入質(zhì)量分析器，以明確起始飛行時間。離子組可以由脈沖式離子化(如基質(zhì)輔助激光解吸離子化)產(chǎn)生，也可通過門控系統(tǒng)將連續(xù)產(chǎn)生的離子流在給定時間引入飛行管。
 
　　飛行時間分析器的質(zhì)量分析上限約15000道爾頓、離子傳輸效率高(尤其是譜圖獲取速度快)、質(zhì)量分辨率>104。
 
　　⑤離子回旋共振分析器（ICR）
 
　　在高真空(~10-7Pa)狀態(tài)下，離子在超導(dǎo)磁場中作回旋運動，運行軌道隨著共振交變電場而改變。當(dāng)交變電場的頻率和離子回旋頻率相同時，離子被穩(wěn)定加速，軌道半徑越來越大，動能不斷增加。關(guān)閉交變電場，軌道上的離子在電極上產(chǎn)生交變的像電流。利用計算機進行傅里葉變換，將像電流信號轉(zhuǎn)換為頻譜信號，獲得質(zhì)譜。
 
　　待測化合物的離子化和質(zhì)量分析可以在同一分析器內(nèi)完成。離子回旋共振分析器的質(zhì)量分析上限>104 道爾頓，分辨率高達106，質(zhì)荷比測定精確到千分之一，可以進行多級質(zhì)譜(MSn)分析。
 
　　⑥串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）
 
　　串聯(lián)質(zhì)譜是時間上或空間上兩級以上質(zhì)量分析的結(jié)合，測定第一級質(zhì)量分析器中的前體離子(precursorion)與第二級質(zhì)量分析器中的產(chǎn)物離子(production)之間的質(zhì)量關(guān)系。多級質(zhì)譜實驗常以 MSn表示。
 
　　產(chǎn)物離子掃描(product-ion scan)：在第一級質(zhì)量分析器中選擇某m/z的離子作為前體離子，測定該離子在第二級質(zhì)量分析器中、一定的質(zhì)量范圍內(nèi)的所有碎片離子(產(chǎn)物離子)的質(zhì)荷比與相對強度，獲得該前體離子的質(zhì)譜。
 
　　前體離子掃描(precursor-ion scan)：在第二級質(zhì)量分析器中選擇某 m/z 的產(chǎn)物離子，測定在第一級質(zhì)量分析器中、一定的質(zhì)量范圍內(nèi)所有能產(chǎn)生該碎片離子的前體離子。
 
　　中性丟失掃描(neutral-loss scan)：以恒定的質(zhì)量差異，在一定的質(zhì)量范圍內(nèi)同時測定第一級、第二級質(zhì)量分析器中的所有前體離子和產(chǎn)物離子，以發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生特定中性碎片(如CO2)丟失的化合物或同系物。
 
　　選擇反應(yīng)檢測(selected-reaction monitoring，SRM)：選擇第一級質(zhì)量分析器中某前體離子(m/z)1，測定該離子在第二級質(zhì)量分析器中的特定產(chǎn)物離子(m/z)2 的強度，以定量分析復(fù)雜混合物中的低濃度待測化合物。
 
　　多反應(yīng)檢測(multiple-reaction monitoring，MRM)：是指同時檢測兩對及以上的前體離子-產(chǎn)物離子。
 
　　二、測定方法
 
　　在進行供試品分析前，應(yīng)對測定用單級質(zhì)譜儀或串聯(lián)質(zhì)譜儀進行質(zhì)量校正?？刹捎脜⒈任镔|(zhì)單獨校正或與被測物混合測定校正的方式。
 
　　1、定性分析
 
　　以質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，以離子的相對豐度為縱坐標(biāo)，測定物質(zhì)的質(zhì)譜。高分辨質(zhì)譜儀可以測定物質(zhì)的準(zhǔn)確分子質(zhì)量。
 
　　在相同的儀器及分析條件下，直接進樣或流動注射進樣，分別測定對照品和供試品的質(zhì)譜，觀察特定 m/z 處離子的存在，可以鑒別藥物、雜質(zhì)或非法添加物。產(chǎn)物離子掃描可以用于極性的大分子化合物的鑒別。復(fù)雜供試品中待測成分的鑒定，應(yīng)采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或串聯(lián)質(zhì)譜儀。
 
　　質(zhì)譜中不同質(zhì)荷比離子的存在及其強度信息反映了待測化合物的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果，可以推測或確證待測化合物的分子結(jié)構(gòu)。當(dāng)采用電子轟擊離子化時，可以通過比對待測化合物的質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)譜庫譜圖的一致性，快速鑒定化合物。未知化合物的結(jié)構(gòu)解析，常常需要綜合應(yīng)用各種質(zhì)譜技術(shù)并結(jié)合供試品的來源，必要時還應(yīng)結(jié)合元素分析、光譜分析(如核磁共振、紅外光譜、紫外光譜、X 射線衍射)的結(jié)果綜合判斷。
 
　　2、定量分析
 
　　采用選擇離子檢測(selected-ion monitoring，SIM)或選擇反應(yīng)檢測或多反應(yīng)檢測，外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)化合物可以是待測化合物的結(jié)構(gòu)類似物或其穩(wěn)定同位素(如2H，13C，15N)標(biāo)記物。
 
　　分別配制一定濃度的供試品及雜質(zhì)對照品溶液，色譜-質(zhì)譜分析。若供試品溶液在特征 m/z 離子處的響應(yīng)值(或響應(yīng)值之和)小于雜質(zhì)對照品溶液在相同特征 m/z 離子處的響應(yīng)值(或響應(yīng)值之和)，則供試品所含雜質(zhì)符合要求。
 
　　復(fù)雜樣本中的有毒有害物質(zhì)、非法添加物、微量藥物及其代謝物的色譜-質(zhì)譜分析，宜采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。通過測定相同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在特征 m/z 離子處的響應(yīng)值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。按規(guī)定制備供試品溶液，測定其在特征 m/z 離子處的響應(yīng)值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程計算，得到待測物的濃度。內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線法是將等量的內(nèi)標(biāo)加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中，測定待測物與內(nèi)標(biāo)物在各自特征 m/z 離子處的響應(yīng)值，以響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，待測物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)時，可以獲得更好的分析精密度和準(zhǔn)確度。
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