BY-0795 L-M(TK-)小鼠結(jié)締組織細胞系
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- 公司名稱 上海乾思生物科技有限公司
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- 更新時間 2025/7/14 11:18:04
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L-M(TK-)小鼠結(jié)締組織細胞系
L-M(TK-)小鼠結(jié)締組織細胞系源自 C3H 小鼠的皮下結(jié)締組織，是經(jīng) 5 - 溴脫氧尿苷篩選獲得的胸苷激酶（TK）缺陷型細胞系，在基因重組、病毒增殖及嘧啶代謝研究中具有重要價值，尤其因 TK 缺陷特性成為 HAT 選擇系統(tǒng)的理想宿主細胞，為哺乳動物細胞基因編輯技術(shù)提供了關(guān)鍵工具。
該細胞系呈現(xiàn)典型的成纖維細胞形態(tài)與表型特征。顯微鏡下，細胞呈長梭形或不規(guī)則星形，以貼壁生長為主，排列呈放射狀或漩渦狀，細胞體積較大（長徑 30-50μm），核質(zhì)比低，細胞核呈橢圓形，染色質(zhì)呈細顆粒狀，可見 1-2 個核仁，核分裂象每 10 個高倍視野 2-3 個，胞質(zhì)豐富，呈弱嗜堿性，可見細長胞質(zhì)突起，電鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體，符合結(jié)締組織細胞的超微結(jié)構(gòu)特點。免疫表型分析顯示，細胞高表達間葉組織標志物 vimentin（陽性率 98%），流式細胞術(shù)檢測顯示其 vimentin 表達強度顯著高于上皮細胞系，而上皮標志物 CK 表達陰性，證實其純結(jié)締組織來源特性。
體外培養(yǎng)體系中，L-M (TK?) 細胞展現(xiàn)出穩(wěn)定的貼壁增殖能力與du特的代謝缺陷。最適培養(yǎng)條件為含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期約 72 小時，倍增時間約 50 小時，與正常成纖維細胞增殖速率接近。其核心特征是胸苷激酶基因（TK1）缺失，導(dǎo)致無法利用外源性胸苷合成 DNA，在含 HAT（次黃piao呤、氨基蝶呤、胸苷）的培養(yǎng)基中無法存活（48 小時死亡率達 100%），而在普通培養(yǎng)基中生長正常，這種選擇性存活特性使其成為基因轉(zhuǎn)移實驗的理想受體細胞。與野生型 L-M 細胞相比，其在含胸苷類似物（如 5 - 氟脫氧尿苷）的培養(yǎng)基中存活率更高（達 80%，野生型細胞僅 10%），證實其嘧啶代謝途徑的du特性。軟瓊脂克隆形成率約 15%，克隆形態(tài)呈不規(guī)則扇形，連續(xù)傳代 60 次后，vimentin 表達及 TK 缺陷特性無明顯改變，凍存復(fù)蘇存活率超 95%。
在基因重組研究中，L-M (TK?) 細胞是 HAT 選擇系統(tǒng)的經(jīng)典模型。轉(zhuǎn)染實驗顯示，將含 TK 基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細胞后，僅成功整合外源基因的細胞可在 HAT 培養(yǎng)基中存活，陽性克隆率達 30%，顯著高于其他選擇系統(tǒng)（如 G418 篩選的陽性率 15%）。這種高效篩選特性使其廣泛應(yīng)用于基因互補實驗，通過導(dǎo)入野生型基因可恢復(fù)相應(yīng)表型，例如導(dǎo)入 TK 基因后，細胞在 HAT 培養(yǎng)基中的存活率從 0 提升至 90%，DNA 合成速率恢復(fù)至野生型水平的 85%。與其他缺陷型細胞系（如 CHO-K1）相比，其轉(zhuǎn)染效率更高（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率達 40%），適合大規(guī)?；蛭膸旌Y選。
病毒增殖研究證實其對多種病毒的易感特性。感染實驗顯示，該細胞可支持單純皰疹病毒（HSV）、痘苗病毒及小鼠白血病病毒的復(fù)制，HSV 感染后 24 小時病毒滴度達 10?PFU/mL，顯著高于 Vero 細胞（10?PFU/mL）。因 TK 缺陷，其對 HSV 的 TK 依賴性突變株更敏感（空斑形成率是野生型病毒的 2 倍），這一特性被用于病毒減毒疫苗的篩選。電鏡觀察顯示，病毒在細胞內(nèi)可完成完整的復(fù)制周期，HSV 感染后可見核內(nèi)病毒顆粒裝配及胞質(zhì)內(nèi)出芽過程，與野生型細胞相比，病毒釋放效率無明顯差異（約 50%）。
嘧啶代謝機制研究揭示其te有的補救途徑缺陷。酶活性測定顯示，細胞內(nèi)胸苷激酶活性僅為野生型 L-M 細胞的 1% 以下，導(dǎo)致無法利用外源性胸苷合成脫氧胸苷三磷酸（dTTP），必須依賴從頭合成途徑（由尿苷酸合成 dTTP）。同位素標記實驗證實，1?C - 胸苷摻入 DNA 的量僅為野生型細胞的 0.5%，而 1?C - 尿苷摻入量增加 20%，補償了補救途徑的缺陷。當從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷（HAT 培養(yǎng)基中），因無法利用胸苷，DNA 合成停滯導(dǎo)致細胞死亡，這一機制是 HAT 篩選的理論基礎(chǔ)。與其他嘧啶代謝缺陷細胞系相比，其代謝表型更穩(wěn)定，無回復(fù)突變（突變率＜10??）。
在藥物篩選應(yīng)用中，該細胞系是抗代謝藥物研究的重要工具?；谄浯x特性，可用于區(qū)分藥物對從頭合成途徑與補救途徑的抑制作用，例如甲an蝶呤（抑制從頭合成）對其 IC50 為 0.1μM，顯著低于野生型細胞（IC50 1μM），而胸苷類似物（抑制補救途徑）對其 IC50 則顯著高于野生型細胞（差異達 10 倍）。在抗病du藥物篩選中，其對 HSV 胸苷激酶激活的前體藥物（如阿xi洛韋）敏感性較低（IC50 是野生型細胞的 5 倍），可用于評估藥物的 TK 依賴性。
基因編輯研究中，L-M (TK?) 細胞是同源重組實驗的理想模型。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因修復(fù)實驗顯示，通過靶向?qū)?TK 基因，可使 HAT 抗性克隆的同源重組效率達 5×10??，顯著高于非同源末端連接效率（1×10??）。利用該細胞系成功構(gòu)建了多種基因敲除模型，如敲除 p53 基因后，細胞對輻射的抗性增加 3 倍，證明其在基因功能研究中的價值。與胚胎干細胞相比，其培養(yǎng)更簡便，無需飼養(yǎng)層細胞，適合高通量基因編輯實驗。
在生物制藥應(yīng)用中，該細胞系可用于生產(chǎn)重組蛋白。轉(zhuǎn)染人干擾素 -β 基因后，細胞分泌量達 500IU/mL?24h，顯著高于原代細胞，且蛋白糖基化模式與天然蛋白一致。因無內(nèi)源性病毒污染，符合生物制品生產(chǎn)的安全標準，已用于多種細胞因子的小規(guī)模制備。其貼壁生長特性適合微載體大規(guī)模培養(yǎng)，在攪拌式生物反應(yīng)器中密度可達 1×10?細胞 /mL，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了潛力。
腫瘤轉(zhuǎn)化研究顯示，該細胞系保留一定的惡性轉(zhuǎn)化潛能。經(jīng)甲基膽蒽處理后，細胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切?，增殖速率加快（倍增時間縮短至 35 小時），軟瓊脂克隆形成率提升至 40%，接種裸鼠后成瘤率達 60%，證實其可作為化學(xué)致癌劑篩選模型。與其他永生化細胞系相比，其轉(zhuǎn)化表型更易檢測，適合早期致癌機制研究。
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