活性氧檢測試劑盒說明書

產(chǎn)品名稱：活性氧檢測試劑盒

Reactive oxygen species assay kit

貨號：CC1610

規(guī)格：100-500T

產(chǎn)品內(nèi)容：

產(chǎn)品簡介：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物(O2•^?, H2O2, •OH, ONOO^?, •NO)等，參與細(xì)胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今zui常用、zui靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測探針。DCFH-DA沒有熒光，進入細(xì)胞后被酯酶水解為dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時DCFH被氧化為不能透過細(xì)胞膜的強綠色熒光物質(zhì)dichlorofluorescein (DCF)，其熒光在激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長530 nm附近有zui大波峰，強度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。此活性氧檢測系統(tǒng)本底低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便。

本試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測，熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等定量ROS檢測。

操作步驟：      

一、試劑準(zhǔn)備：

1. DCFH-DA可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響DCFH-DA及細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生，但可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀熒光測定?？蓪?/span>DCFH-DA稀釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如PBS中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進行測定。

2. 加入DCFH-DA的時機或孵育時間，以zui終能順利檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時間較短(<2小時)或預(yù)計ROS效應(yīng)較弱，可先加或同時加入DCFH-DA。反之，處理刺激時間較長(>6小時)或預(yù)計產(chǎn)生ROS效應(yīng)較強，可后加DCFH-DA。

3. 活性氧供體含高純度12 mM H2O2。加入細(xì)胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化為DCF呈現(xiàn)強綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測試實驗系統(tǒng)或儀器的陽性試劑，以初步觀察細(xì)胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實際作為實驗的一個陽性對照。*該試劑的細(xì)胞工作濃度為20~100 µM或更低濃度，但超過200µM將產(chǎn)生細(xì)胞毒。如果用戶熟悉ROS熒光或?qū)嶒灈]有必要采用陽性對照，可以不加該試劑。

二、加入熒光探針：

1. 加入DCFH-DA于培養(yǎng)基，*初始工作濃度為10µM。對不同的細(xì)胞和處理，DCFH-DA工作濃度可為100 nM~20µM，需進行預(yù)實驗確定合適的濃度?？傮w稀釋倍數(shù)應(yīng)在1:500~1000以上以避免DMSO對細(xì)胞的影響。以DMSO作為溶劑對照。

2. 37 oC孵育細(xì)胞30min至幾個小時，通常30-60min即可。孵育時間長短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度有關(guān)。

3. PBS洗滌細(xì)胞2次。

三、熒光檢測

采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測照相，綠色熒光強度代表活性氧水平。也可進行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實時或每10分鐘分時逐點檢測熒光強弱。對于流式細(xì)胞儀可將細(xì)胞用胰酶消化PBS洗滌后重懸檢測。