【檢驗方法】

試劑準備

檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫。 如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×濃縮洗液 30 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水或去離子水至600 ml，輕輕混勻，避免泡 沫。 轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 - 25℃貯存，1×洗液可穩(wěn)定 30 天。

1×檢測緩沖液

 吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水或去離子水至 50 ml，輕輕混勻，避 免泡沫。 2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖液可穩(wěn)定保存 30 天。

檢測抗體

稀釋前充分混勻。根據(jù)標準品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的檢 測抗體。 注意：請在 30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的檢測抗體。

 辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素

稀釋前充分混勻。 根據(jù)標準品和待測樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1：100 稀釋濃縮的辣根過氧化物酶標記的 鏈霉親和素。 注意：請在 30 分鐘內(nèi)使用稀釋后的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

樣本稀釋

如果樣本需要稀釋，請用試劑盒提供的 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細胞培養(yǎng)基稀釋 細胞培養(yǎng)上清。

大鼠IFN-γ 標準品

用蒸餾水或去離子水重溶大鼠IFN-γ標準品，重溶體積標注在大鼠IFN-γ標準品。輕柔 地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標準品的濃度為8000 pg/ml。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋 前充分混勻。 請使用聚丙烯管進行標準品稀釋。

標準曲線制作

血清/血漿樣本標準曲線的制作：

取 150 μl 濃縮的大鼠IFN-γ標準品，加入 150 μl 標準品稀釋液，作為標準曲線的最高濃度 (4000pg/ml)。在每一個試管中加入 150 μl 標準品稀釋液。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移 液時，請確保充分混勻。以標準品稀釋液作為標準曲線的零濃度。

（標準品濃度依次是：4000,2000，1000,500,250，125,62.5, 0pg/mL） 

細胞培養(yǎng)上清樣本標準曲線的制作： 

取 150 μl 濃縮的大鼠IFN-γ標準品，加入 150 μl 細胞培養(yǎng)基，作為標準曲線的最高濃度 (4000pg/ml)。在每一個試管中加入 150 μl 細胞培養(yǎng)基。使用高濃度標準品做 1：1 系列稀釋。每次移液 時，確保充分混勻。以細胞培養(yǎng)基作為標準曲線的零濃度。

（標準品濃度依次是：4000,2000，1000,500,250，125,62.5, 0pg/mL） 

【檢測步驟】 

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫。

1. 準備好所有需要的試劑及工作濃度標準品。

 2. 將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。

3. 加入 300 μl 1×洗液靜置浸泡 30 秒。為了獲得理想的實驗結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后， 在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。

4. 標準品孔加入 50 μl 1x檢測緩沖液和50ul2倍倍比稀釋的標準品。空白孔加入 50ul 1x 檢測緩沖液和50ul標準品稀釋液。

5. 樣本孔加入 80μl 1×檢測緩沖液和 20 μl 樣本。

6. 每孔加入 50 μl 稀釋的檢測抗體。保證步驟 4、5、6 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 15 分 鐘內(nèi)完成。

7. 使用封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育 1.5小時。

8. 棄掉液體，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗滌 6 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的 實驗性能，必須*移除殘留液體。

9. 每孔加入 100 μl 稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。

10. 使用新的封板膜封板。300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育30分鐘。

11. 重復(fù)步驟 8。

12. 每孔加入 100 μl 顯色底物 TMB，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。

13. 每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均 勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。

14. 在 30 分鐘之內(nèi)，使用酶標儀進行雙波長檢測，測定 450 nm 最大吸收波長和 570 nm 或 630 nm 參考波長下的 OD 值。校準后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。 僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD 值偏高，并且準確度降低。

【檢驗方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋后，再重新測定。

6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排除該因素。

7、通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。