人胃泌素(Gastrin)ELISA分析檢測(cè)試劑盒相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

抗人胃泌素單克隆抗體及其單鏈抗體的研制
摘要：建立能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,在對(duì)其親和力、特異性以及生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上,克隆抗人胃泌素單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,構(gòu)建抗人胃泌素單鏈抗體基因,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定。方法:以胃泌素合成肽與鑰孔戚血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物為免疫原,采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌高親和力抗人胃泌素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,大量制備并經(jīng)鹽析、蛋白G親和層析獲得純化的單克隆抗體,采用SDS-PAGE對(duì)抗體進(jìn)行分子量和純度鑒定,間接ELISA法檢測(cè)效價(jià),雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)鑒定類和亞類,非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力,斑點(diǎn)ELISA和免疫組化鑒定特異性,并且分別采用熒光染色法和MTT比色法,研究其對(duì)胃泌素/胃泌素受體結(jié)合的阻斷作用,以及對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,選擇雜交瘤細(xì)胞株E8,用TRIZOL試劑提取總RNA,通過(guò)RT-PCR,采用小鼠重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通用引物,擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因。通過(guò)重疊延伸PCR將兩個(gè)可變區(qū)基因通過(guò)連接肽基因連接起來(lái),構(gòu)建單鏈抗體基因,克隆到pGEM-T載體中,通過(guò)酶切、PCR和測(cè)序進(jìn)行鑒定。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑，不得用于臨床診斷。
檢測(cè)種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測(cè)試劑盒等種屬。
標(biāo)本：血清、血漿、細(xì)胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 
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人胃泌素(Gastrin)ELISA分析檢測(cè)試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標(biāo)本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，通過(guò)反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

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BYK-1713R DRD5 receptor/FITC  熒光素標(biāo)記抗多巴胺受體-D5抗體IgG
BYK-1692R DAP-5/p97 /FITC  熒光素標(biāo)記死亡相關(guān)蛋白5抗體IgG
BYK-1714R DAPK1/FITC  熒光素標(biāo)記凋亡相關(guān)蛋白激酶1抗體IgG
BYK-0596R DAPK2/FITC  熒光素標(biāo)記凋亡相關(guān)蛋白激酶2抗體IgG
BYK-0592R DAPK3/FITC  熒光素標(biāo)記凋亡相關(guān)蛋白激酶3抗體IgG
BYK-2556R DAT1/FITC  熒光素標(biāo)記抗多巴胺相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1抗體IgG
BYK-2557R DBH /FITC  熒光素標(biāo)記多巴胺β羥化酶抗體IgG
BYK-2563R DCC/FITC  熒光素標(biāo)記兔抗結(jié)直腸癌缺失基因抗體IgG
BYK-2564R DC-LAMP/LAMP-3/CD208/FITC  熒光素標(biāo)記CD208抗體IgG
BYK-1695R DC-SIGN/CD209/CLEC4L/FITC  熒光素標(biāo)記CD209抗體IgG
BYK-1037R DC-SIGNR/CD299/FITC  熒光素標(biāo)記CD299抗體IgG
BYK-1269R DCIR/CLEC4A/FITC  熒光素標(biāo)記C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員A抗體IgG
BYK-2588R DCN/FITC  熒光素標(biāo)記抗核心蛋白聚糖抗體IgG
BYK-2599R DCP/FITC  熒光素標(biāo)記異常凝血酶原/脫-γ-羧基凝血酶原抗體IgG
BYK-0180R DCX/FITC  熒光素標(biāo)記雙皮質(zhì)素抗體IgG
BYK-2565R DDB1/FITC  熒光素標(biāo)記損傷DNA結(jié)合蛋白1抗體IgG
BYK-2455R DDB2/FITC  熒光素標(biāo)記損傷DNA結(jié)合蛋白2抗體IgG

ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。