人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ELISA檢測試劑盒相關(guān)實驗研究：

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）表達(dá)與豬瘟病毒感染相關(guān)性研究
摘要：豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的一種傳染病,嚴(yán)重威脅到養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物疫病,我國將其列為一類動物疫病。我國研制出的豬瘟兔化弱毒疫苗雖然在豬瘟的預(yù)防控制方面起了很大的作用,然而近年來慢性豬瘟和非典型豬瘟不斷發(fā)生,給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失。CSFV致病機(jī)理的闡明將有助于豬瘟的防控。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase,PDI)是一種分子伴侶,已經(jīng)證明其在囊膜病毒侵入宿主細(xì)胞的過程中有重要作用,并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中也扮演重要角色。但PDI與CSFV的侵染機(jī)制是否有相關(guān)性,目前知之甚少。本研究建立了PDI實時熒光定量PCR檢測方法,實現(xiàn)CSFV感染后,宿主組織及細(xì)胞水平的PDI表達(dá)檢測。并在巨噬細(xì)胞中構(gòu)建載體采用PDI過表達(dá)技術(shù),研究分析CSFV與宿主細(xì)胞PDI之間可能的相互作用。(1)設(shè)計豬組織及細(xì)胞系PDI基因特異性擴(kuò)增引物,利用RT-PCR擴(kuò)增PDI基因,連接到pMD 19-T載體制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實驗試劑，不得用于臨床診斷。
檢測種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬。
標(biāo)本：血清、血漿、細(xì)胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 
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人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ELISA檢測試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標(biāo)本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中如有沉淀，請再次離心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，通過反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測，其余冷凍備用。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。