人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ELISA檢測試劑盒相關實驗研究：

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）表達與豬瘟病毒感染相關性研究
摘要：豬瘟是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的豬的一種傳染病,嚴重威脅到養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物疫病,我國將其列為一類動物疫病。我國研制出的豬瘟兔化弱毒疫苗雖然在豬瘟的預防控制方面起了很大的作用,然而近年來慢性豬瘟和非典型豬瘟不斷發(fā)生,給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大經(jīng)濟損失。CSFV致病機理的闡明將有助于豬瘟的防控。蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide isomerase,PDI)是一種分子伴侶,已經(jīng)證明其在囊膜病毒侵入宿主細胞的過程中有重要作用,并且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中也扮演重要角色。但PDI與CSFV的侵染機制是否有相關性,目前知之甚少。本研究建立了PDI實時熒光定量PCR檢測方法,實現(xiàn)CSFV感染后,宿主組織及細胞水平的PDI表達檢測。并在巨噬細胞中構(gòu)建載體采用PDI過表達技術,研究分析CSFV與宿主細胞PDI之間可能的相互作用。(1)設計豬組織及細胞系PDI基因特異性擴增引物,利用RT-PCR擴增PDI基因,連接到pMD 19-T載體制備質(zhì)粒標準品。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），elisa試劑盒參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實驗試劑，不得用于臨床診斷。
檢測種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬。
標本：血清、血漿、細胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 
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人蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)ELISA檢測試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類標本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，如保存過程中如有沉淀，請再次離心。
血漿：
應根據(jù)標本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
細胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，當細胞濃度達到100萬/ml左右，通過反復凍融，使細胞破壞并釋放細胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
組織標本：
切割標本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，標本融化后仍保?-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，分裝后留一份待檢測，其余冷凍備用。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易*保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。