CD4和CD8是T淋巴細胞表面的糖蛋白,與淋巴細胞的抗原識別及其自身活化密切相關(guān). CD4分子主要位于輔助性T淋巴細胞表面,參與細胞免疫并對體液免疫進行調(diào)控.CD8分子主要位于細胞毒性T淋巴性細胞表面,是細胞免疫的重要效應(yīng)細胞,細胞表面的CD8分子主要有αα同源二聚體或αβ異質(zhì)二聚體兩種.本研究針對NCBI上公布的四川白鵝CD4(GenBank:JX902315)以及CD8α(GenBank: KC476104)分子序列設(shè)計引物合成胞外去信號肽區(qū)進行克隆,在PET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系統(tǒng)中進行原核表達,以IPTG誘導(dǎo)獲得重組融合蛋白,Ni-NTA親和層析獲得純化蛋白,并以此作為免... 展開 CD4和CD8是T淋巴細胞表面的糖蛋白,與淋巴細胞的抗原識別及其自身活化密切相關(guān). CD4分子主要位于輔助性T淋巴細胞表面,參與細胞免疫并對體液免疫進行調(diào)控.CD8分子主要位于細胞毒性T淋巴性細胞表面,是細胞免疫的重要效應(yīng)細胞,細胞表面的CD8分子主要有αα同源二聚體或αβ異質(zhì)二聚體兩種.本研究針對NCBI上公布的四川白鵝CD4(GenBank:JX902315)以及CD8α(GenBank: KC476104)分子序列設(shè)計引物合成胞外去信號肽區(qū)進行克隆,在PET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系統(tǒng)中進行原核表達,以IPTG誘導(dǎo)獲得重組融合蛋白,Ni-NTA親和層析獲得純化蛋白,并以此作為免疫原制備兔抗鵝CD4或CD8α以及鼠抗鵝CD4或CD8α胞外區(qū)的多克隆抗體.進一步利用純化的抗體,分別建立了能夠特異性檢測鵝T細胞表面分子CD4或CD8α蛋白的細胞ELISA(Cell Marker ELISA)以及雙抗體夾心ELISA(DAS-ELSIA)方法,通過檢測機體內(nèi)CD4以及CD8α蛋白,揭示體內(nèi)T淋巴細胞的活化,分化情況,為監(jiān)控鵝細胞免疫水平提供技術(shù)支持. 鵝CD4/CD8α胞外區(qū)的原核表達 鵝CD4基因的cDNA全長有1940個堿基,ORF為1443bp,編碼480個氨基酸,本課題選取第85位到第1279位的編碼398個氨基酸的胞外去信號肽區(qū)進行克隆表達.鵝CD8α基因的cDNA全長由1459個堿基構(gòu)成,其中ORF為711bp,總共編碼236個氨基酸,本文選取第99位到578位的編碼160個氨基酸的胞外去信號肽區(qū)進行克隆表達. 針對四川白鵝CD4以及CD8α胞外區(qū)基因分別設(shè)計特異性引物進行擴增,并選取PET-32a(+)作為原核表達的表達載體.經(jīng)過酶切連接,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒goCD4-PET-32a和goCD8α-PET-32a,并轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3) pLysS感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達.對其表達產(chǎn)物進行