Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明

一、核心檢測原理

• Annexin V：一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可高特異性、高親和力地與膜外 PS 結(jié)合，通過熒光標(biāo)記（如 FITC，異硫氰酸熒光素）實現(xiàn)對凋亡早期細胞的識別。
• PI（碘化丙啶）：一種核酸染料，無法透過完整細胞膜，但可進入膜破損的細胞（如凋亡晚期細胞或壞死細胞），與 DNA 結(jié)合發(fā)出紅色熒光，用于區(qū)分凋亡晚期 / 壞死細胞與活細胞、凋亡早期細胞。

• 活細胞：Annexin V?/PI?（無熒光）
• 凋亡早期細胞：Annexin V?/PI?（僅綠色熒光）
• 凋亡晚期細胞：Annexin V?/PI?（綠色 + 紅色熒光）
• 壞死細胞：Annexin V?/PI?（僅紅色熒光，膜完整性早于凋亡被破壞）

二、試劑盒組成（典型配置）

1. Annexin V-FITC：熒光標(biāo)記的 Annexin V，通常溶于含防腐劑的緩沖液中，避光保存。
2. PI 染色液：高濃度 PI 溶液（需稀釋使用），具有潛在毒性和誘變作用，操作時需注意防護。
3. Binding Buffer：含鈣離子的緩沖液，維持 Annexin V 與 PS 結(jié)合所需的離子環(huán)境，避免使用無鈣緩沖液（如 PBS）替代。
4. 說明書：包含具體稀釋比例、染色時間、操作步驟及注意事項。

三、實驗操作關(guān)鍵步驟

1. 細胞收集：貼壁細胞需用胰酶消化（避免過度消化導(dǎo)致細胞膜損傷），懸浮細胞直接離心收集，用冷 PBS 洗滌 2 次以去除培養(yǎng)基成分。
2. 洗滌與重懸：將細胞重懸于 Binding Buffer 中，調(diào)整濃度至 1×10? cells/mL，確保細胞狀態(tài)良好（避免機械損傷導(dǎo)致的假陽性）。
3. 雙染反應(yīng)：每 100μL 細胞懸液中加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI，室溫避光孵育 5-15 分鐘（時間過短可能染色不充分，過長可能導(dǎo)致 PI 非特異性進入活細胞）。
4. 檢測：
   • 流式細胞術(shù)：孵育后加入 400μL Binding Buffer，1 小時內(nèi)上機檢測，激發(fā)波長 488nm，F(xiàn)ITC 檢測通道為 FL1（綠色熒光），PI 檢測通道為 FL2 或 FL3（紅色熒光）。
   • 熒光顯微鏡：滴加染色后的細胞懸液至載玻片，封片后觀察，凋亡早期細胞呈綠色，凋亡晚期細胞呈黃橙色，壞死細胞呈紅色。

四、應(yīng)用場景

• 基礎(chǔ)研究：探究藥物、輻射、細胞因子等對細胞凋亡的誘導(dǎo)或抑制作用。
• 臨床檢測：評估腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，監(jiān)測免疫細胞的凋亡狀態(tài)。
• 毒理學(xué)研究：檢測化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素對細胞的毒性及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。

五、注意事項

1. 避光操作：FITC 和 PI 均易受光漂白，染色及孵育過程需避光，流式檢測前樣本需置于冰上并盡快上機。
2. 鈣離子依賴：Binding Buffer 中的鈣離子是 Annexin V 結(jié)合 PS 的關(guān)鍵，若緩沖液含鈣量不足，會導(dǎo)致染色效率下降。
3. 細胞濃度：過高的細胞濃度可能導(dǎo)致熒光信號疊加，影響結(jié)果分析，建議調(diào)整至 1×10? cells/mL 左右。
4. 對照設(shè)置：需設(shè)置空白對照（未染色細胞）、單染對照（僅 Annexin V-FITC 或 PI）用于流式細胞術(shù)的熒光補償調(diào)節(jié)。