miRNA Real-Time PCR Assay kit

miRNA 熒光定量 PCR 檢測試劑盒

miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)

目錄號：71419

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 24 個月。

qPCR Mix 使用前，充分融解，輕柔顛倒混勻，短期使用可放在 4 ℃，避免反復(fù)凍融。

Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。

產(chǎn)品簡介

miRNA Real-Time PCR Assay kit 采用 SYBR Green I 嵌合染料法的原理進行 miRNA 熒光定量檢測。

其中2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix是專門為miRNA 定量檢測而研發(fā)的新一代2x預(yù)混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是全新的 Hotmaster Taq DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR 結(jié)果，具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等特點。

預(yù)混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時不需要額外添加ROX來校正儀器。

注意：該試劑盒需要與增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（加尾法）配套使用。

1. 需要自備的試劑：待檢測miRNA對應(yīng)的qPCR上游引物（Forward primer）

2. 待檢測miRNA對應(yīng)的qPCR上游引物（Forward primer）

Forward Primer設(shè)計原則：

1. 遵循引物設(shè)計的zui普遍原則。

2. 以成熟的miRNA 序列為基礎(chǔ)，將U 替換成T，這是最基礎(chǔ)和zui簡單的設(shè)計方法。

3. 試劑盒中提供的下游引物的Tm 值為65℃，設(shè)計上游引物的Tm 值要盡量保證在65℃左右。

4. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計的引物其Tm 值過低，可以在引物的5’端添加幾個堿基（最好為G 或C 堿基）；也可以在3’端添加1 個或幾個A 堿基；或者5’端和3’端同時修飾。

5. 若按照原則2 的方式直接設(shè)計的引物其Tm 值過高，可以在引物的5’或3’端去掉幾個堿基。

操作步驟：

1. 將DNA模板、引物、2x Universal miRNA SYBR Green qPCR Mix、RNase-Free H2O溶解并置冰上備用。

2. 使用時請將2 x miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)輕微離心后使用。

3. 冰上配制qPCR反應(yīng)體系：（以20μl反應(yīng)體系為例）

1） 推薦模板加樣量為1-2μl / 20μl反應(yīng)體系，miRNA 第一鏈cDNA不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%，對于特殊的檢測體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴增，根據(jù)所檢測miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂?/span>cDNA（10倍或者100倍）。

2） 本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應(yīng)液時應(yīng)避免強光照射。

3） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)效果不佳時可在0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)進行調(diào)整。擴增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

4. qPCR反應(yīng)程序

注意：

1） 絕大多數(shù)情況下，使用二步法或三步法均可獲得良好效果。二步法擴增特異性高，三步法擴增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試加長延伸時間或者進行三步法PCR擴增。

2） 根據(jù)引物的Tm值進行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定；

3） 延伸（退火&延伸）時間的設(shè)置還需要根據(jù)您所使用的qPCR儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整。

4） 融解曲線分析請以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進行設(shè)定。

miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(加尾法)