【使用步驟】

（1）工作液配制

稀釋方法：用培養(yǎng)基或緩沖液將1 mM儲存液稀釋至1–5 μM（推薦≥1 μM），現(xiàn)配現(xiàn)用，避光操作。

優(yōu)化建議：低濃度可減少假陽性，染色后若熒光減弱需避免長時間孵育。

（2）細(xì)胞染色流程

貼壁細(xì)胞：

細(xì)胞鋪于蓋玻片，80%融合后吸除培養(yǎng)液。

加入37℃預(yù)熱的含探針培養(yǎng)基，孵育30分鐘–2小時。

PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察。

懸浮細(xì)胞：

離心收集細(xì)胞，用含探針培養(yǎng)基重懸，避光震蕩孵育。

離心后PBS洗滌，熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測。

注意事項：孵育時間過長（>2小時）可能導(dǎo)致溶酶體pH升高（堿性效應(yīng)），建議縮短至5分鐘內(nèi)用于pH檢測。

（3）pH校準(zhǔn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：

用含10 μM尼日利亞菌素的pH校準(zhǔn)緩沖液（pH 3.5–6.0）處理細(xì)胞10分鐘。

測量不同pH下的熒光強(qiáng)度比值，繪制校準(zhǔn)曲線。

【技術(shù)參數(shù)】

試劑名稱：溶酶體黃/藍(lán)熒光探針LysoSensor DND-160

分子式：C20H22N4O3

分子量：366.42 g/mol

顏色：Yellow、blue

外觀：溶液

亞細(xì)胞定位：溶酶體

檢測儀器：熒光顯微鏡

純度：≥95%

儲存條件：-20℃避光干燥

【工作原理】

雙發(fā)射峰特性：

中性環(huán)境（pH≈7）：激發(fā)329 nm，發(fā)射440 nm（藍(lán)色熒光）。

酸性環(huán)境（pH<4.5）：激發(fā)384 nm，發(fā)射540 nm（黃色熒光）。

pKa值：≈4.2，對溶酶體pH高度敏感。

比率分析機(jī)制：

溶酶體黃/藍(lán)熒光探針LysoSensor DND-160通過發(fā)射光譜比率（I???/I???）消除探針濃度、細(xì)胞厚度等干擾，實現(xiàn)定量pH檢測。

激發(fā)等吸點(diǎn)（～360 nm）用于雙發(fā)射峰同步激發(fā)，提高信噪比。

【相關(guān)的試劑】

FITC Phalloidin

APC-Streptavidin

PE-Streptavidin

Mag-520 Potassium Salt

CAY10731(H2S Probe)

PE-Cy7標(biāo)記鏈霉親和素

Indo-1,AM,Cell Permeant

Pentafluorobenzenesulfonyl fluorescein

ZnAF-2F,Cell lmpermeant鋅離子熒光探針

ZnAF-2F DA,Cell Permeant鋅離子熒光探針

Indo-1 Pentapotassium Salt, Cell lmpermeant

PSP (Hydrogen Polysulfide Probe)多硫化氫熒光探針

注意：本試劑用于科研領(lǐng)域，其他用途概不適用！

編輯：以上內(nèi)容由西安強(qiáng)化生物科技xxn整理！