Mouse Colonic Organoid Kit Plus

小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus

1、 產(chǎn)品描述

?；镄∈蠼Y(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝Plus（Mouse Colonic Organoid Kit Plus）是一款用于擴增和分化小鼠結(jié)腸類器官的培養(yǎng)基。擴增時的小鼠結(jié)腸類器官主要由結(jié)腸干細胞和結(jié)腸祖細胞組成，分化后的小鼠結(jié)腸類器官由結(jié)腸吸收細胞、杯狀細胞和少量腸內(nèi)分泌細胞組成。結(jié)腸類器官在自我更新和分化能力、組織結(jié)構(gòu)、細胞類型和功能方面，重現(xiàn)了體內(nèi)結(jié)腸上皮的特征，因此是小鼠結(jié)腸研究的理想體外模型。

2、 產(chǎn)品信息

3、 其他自備試劑和耗材

4、 使用說明小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基使用說明

1、   收到類器官培養(yǎng)基后，將培養(yǎng)基置于4℃冰箱進行解凍；

2、   待培養(yǎng)基解凍后上下顛倒充分混勻，在生物安全柜或潔凈工作臺中根據(jù)日常需求量進行分裝，推薦分裝成10mL/管；

3、   分裝后的培養(yǎng)基請密封后儲存于-20℃，使用時取出分裝的培養(yǎng)基放置室溫平衡后即可使用。

5、 小鼠結(jié)腸類器官的建立與傳代培養(yǎng)

a)     原代小鼠結(jié)腸類器官的建立

1、   取樣：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌條件下取出近盲腸端3~5cm結(jié)腸組織，用鑷子去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含雙抗的DPBS溶液中。

2、   清洗：使用將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用夾住腸組織一端，另一只手使用片輕輕刮去腸腔表面粘液或殘留的糞便，接著將結(jié)腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗。將清洗后的腸碎至25mm寬，隨后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，劇烈震蕩30s(垂直上下震蕩90次一上一下算一次，約1s三次)棄上清，重復3次。

3、   消化：加入30mL的DPBS溶液中再加入150μL 0.5M EDTA，至EDTA終濃度為2.5mM。置4℃搖床上，80rpm，消化60min。

4、   清洗：消化完成后，靜置待腸段沉淀，棄上清。加入預冷DPBS，輕柔搖勻，靜置后棄上清，重復2次以去除EDTA。

5、   重懸：加入30mL預冷的含1%FBS的DPBS，渦旋30s，取上清100μm濾網(wǎng)過濾，收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，記為餾分1。重復收集2次，記為餾分2和餾分3。

6、   收集：300g離心力4℃離心3min。

7、   計數(shù)：棄上清，根據(jù)沉淀量使用DPBS重懸組織沉淀，取20μL懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，300g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。

8、   用適量的基質(zhì)膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10μL基質(zhì)膠懸液包含100至200個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免基質(zhì)膠過早凝固。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

9、   將基質(zhì)膠和組織細胞的混合懸液點入24孔板底部正，每孔30μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

10、 將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。

11、 待基質(zhì)膠凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

12、 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2~3天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應避免破壞基質(zhì)膠。密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠結(jié)腸類器官應在5至7天內(nèi)建成。

b)      小鼠結(jié)腸類器官的傳代培養(yǎng)

1、   用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將結(jié)腸類器官和培養(yǎng)基懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗液潤洗的1.5mLEP管中。

2、   用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3、   300g，4℃離心3min，棄上清，用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭加入200μL類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化1-3min，消化結(jié)束后加入1mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻。

4、   300g，4℃離心3min，棄上清，再次加入1mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基并混勻。

5、   300g，4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。

6、   用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免基質(zhì)膠過早凝固。注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7、   將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入24孔板底部正，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔30μL左右。注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8、   將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

9、   待基質(zhì)膠凝固后，沿孔壁加入提前預熱的小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基，24孔板每孔500μL。

10、 將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進一步的實驗。

V2.0版

更新時間：2025/6/20