PCR實(shí)驗(yàn)室

◆ PCR Laboratory ◆

┃ 定義及應(yīng)用領(lǐng)域

　　 PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過(guò)DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)別，精確檢測(cè)乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時(shí)判斷病人適合使用哪類抗病DU藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)。
     廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。例如：艾滋病檢測(cè)、乙型肝炎、禽疫病、癌基因的檢測(cè)和診斷，DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定及法醫(yī)物證、動(dòng)植物檢疫，動(dòng)物及其衍生產(chǎn)品檢測(cè)，動(dòng)物飼料、化妝品、食品衛(wèi)生檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測(cè)等。

┃ PCR實(shí)驗(yàn)室的核心難題

      實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞同一個(gè)核心問(wèn)題進(jìn)行——“避免污染”，任何級(jí)別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室時(shí)，均需要提前考量各個(gè)因素，以保證標(biāo)本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)室的生物安全。  
1. 建設(shè)要求。PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的“四區(qū)”：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。
2. 人員要求。進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室，需要經(jīng)過(guò)從基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項(xiàng)等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。
3. 檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)過(guò)程中，樣本的開(kāi)蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能生氣溶膠，有感染的風(fēng)險(xiǎn)。
4. 防護(hù)要求。必須按照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求進(jìn)入。

┃ 建立方法

1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。⑹管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì)產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會(huì)。為了避免這一問(wèn)題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。
3、建立前PCR區(qū)
該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
⑴ 所用的所有溶液都應(yīng)該沒(méi)有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。⑸ 所有試劑和樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。⑺樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
⑴ 可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。⑵如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。⑶作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對(duì)照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當(dāng)做陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對(duì)照反應(yīng)，對(duì)照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
6、控制污染的方法
已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
7、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個(gè)專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。

┃ 注意事項(xiàng)
1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室;
2、檢測(cè)設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;
3、必須通過(guò)國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證;
4、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;
5、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作