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PCR儀的使用方法
方法:
1、將DNA加熱(至90~95℃)變性,bai 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板。
2、則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著于模板DNA兩端。 后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進(jìn)行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。
標(biāo)準(zhǔn)PCR儀也叫做終點PCR儀,是指目的基因僅經(jīng)過預(yù)變性、變性、退火、延伸階段產(chǎn)生大量的核酸序列的PCR儀,PE-Cetus公司推出的一臺PCR自動化熱循環(huán)儀屬于此種。
根據(jù)PCR退火溫度和擴(kuò)增條件(細(xì)胞內(nèi)/外),標(biāo)準(zhǔn)PCR又可以分為三類:普通PCR、梯度PCR和原位PCR。
PCR是分子生物學(xué)研究極其重要的工具,是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA段的分子生物學(xué)技術(shù),基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制,即人為創(chuàng)造核酸半保留復(fù)制條件,使目的DNA在細(xì)胞外完成擴(kuò)增的過程,它可被看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。
擴(kuò)展資料
1、普通PCR儀:一般把一次PCR擴(kuò)增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀,稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。主要是用作簡單的、對單一退火溫度的目的基因的擴(kuò)增。主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗、檢疫等。
2、梯度PCR儀:普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴(kuò)增儀。梯度PCR儀每個孔的溫度可以在范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置,一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)。由于被擴(kuò)增的DNA段不同,其退火溫度也不同,通過梯度設(shè)置。
可一次性篩選出的退火溫度。這樣既可節(jié)省試驗時間,提高實驗效率,又能節(jié)約實驗成本。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。
3、原位PCR儀:是將PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來,用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀,從而在組織細(xì)胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定,以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。
細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性,當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,各種成分,如引物、DNA聚合酶、核苷酸等均可進(jìn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi),以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板,于原位進(jìn)行擴(kuò)增。