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磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)

2013-4-2  閱讀(1714)

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磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
   碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

  方法
   1 懸浮細(xì)胞的染色:將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室溫避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反應(yīng)5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan進行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(一般不超過1h), 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
   2 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。
   3 爬片細(xì)胞染色:同上,zui后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。
   結(jié)果:

  注意事項
   1. 整個操作動作要盡量輕柔,勿用力吹打細(xì)胞。
   2. 操作時注意避光,反應(yīng)完畢后盡快在一小時內(nèi)檢測

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