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細胞凋亡的早期檢測方法有哪些?

2014-12-25  閱讀(1556)

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1、PS(磷脂酰絲氨酸)在胞外膜分布的檢測
PS從胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)現(xiàn)象是在細胞凋亡的早期即可發(fā)生標(biāo)志。AnnexinV是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白,能專一性的結(jié)合暴露在胞膜外側(cè)的PS,使用熒光素標(biāo)記的AnnexinV 蛋白(如Annexin V-FITC)即可檢測細胞凋亡。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。操作簡便快速,10分鐘就可完成檢測。靈敏度高,可作為流式方法分析凋亡細胞的基礎(chǔ)。

2、細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測
正常狀態(tài)下,谷胱甘肽(GSH)作為細胞內(nèi)的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而清除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被消化除。在細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細胞內(nèi)GSH的排除非?;钴S時,細胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境,這可能導(dǎo)致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中,啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。

3、細胞色素C的檢測
細胞色素C作為一種信號物質(zhì),在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中,而不存在于胞漿內(nèi)。凋亡信號刺激后可使其從線粒體釋放到胞漿中,結(jié)合Apaf-1后而啟動caspase級聯(lián)活化反應(yīng),首先可激活caspase-9,后者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡發(fā)生的早期,細胞色素C泄漏到胞漿中,檢測胞漿中細胞色素c的含量可反映細胞的早期凋亡。

4、線粒體膜電位變化的檢測
在細胞凋亡的早期,線粒體在形態(tài)學(xué)上沒有明顯變化。但線粒體可發(fā)生很多生理生化的改變。例如在受到凋亡誘導(dǎo)后,線粒體的轉(zhuǎn)膜電位發(fā)生變化,導(dǎo)致膜穿透性改變。MitoSensorTM是一種陽離子染色劑,對此膜電位改變非常敏感,可呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體跨膜電位改變,它則以單體形式停留于胞漿中,發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。

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