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04 2013年 09月: 【瓊脂糖凝膠電泳】真假GelRed對比試驗(yàn)

目前市場上幾種代表性的核酸染料：GelRed是一款集高靈敏度、低毒性和光穩(wěn)定性于一體的核酸凝膠染料。由于染料分子不能透過人體細(xì)胞膜，保證了實(shí)驗(yàn)環(huán)境的安全與潔凈。該產(chǎn)品已通過美國環(huán)保局安全認(rèn)定，廢棄物可直接倒入下水道，不會造成任何環(huán)境污染。EB（溴化乙啶）是早期分子實(shí)驗(yàn)中常用的小分子核酸凝膠染色劑，但染色效果并不靈敏，背景熒光信號太強(qiáng)，分辨率不高。zui重要的EB是一種高誘變性致癌的化學(xué)物質(zhì)。SYBRGreenI和SYBRGold也被廠家宣傳為靈敏的凝膠染色試劑。但SYBRGreenI尤其是SYB
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04 2013年 09月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：生物素酰化探針的檢測實(shí)驗(yàn)

生物素?；结樀臋z測實(shí)驗(yàn)標(biāo)簽：生物素?；结樑c放射性標(biāo)記探針的比活不同，生物素標(biāo)記探針的可檢出性在于每千堿基對中摻入的生物素分子的數(shù)量，它可用比色法檢測。實(shí)驗(yàn)方法比色法化學(xué)發(fā)光法實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒磷酸酶緩沖液封阻液牛血清蛋白TENBT儀器、耗材離心機(jī)分光光度計(jì)搖床實(shí)驗(yàn)步驟1.用DNA稀釋緩沖液，稀釋生物素?；瘶?biāo)準(zhǔn)DNA，濃度為0、1、2、5、10和20pg/μl。以同樣稀釋液處理待測DNA。2.對干硝酸纖維素濾膜：每個(gè)稀釋度取1μl點(diǎn)膜，在80℃供干約1h接步驟4。3.對于足龍膜：每個(gè)稀
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04 2013年 09月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：生物素?；结樀闹苽鋵?shí)驗(yàn)

標(biāo)簽：生物素酰化探針在標(biāo)準(zhǔn)的切口平移實(shí)驗(yàn)體系中，生物素-11-dNTP取代了dNTP，DNA酶I的濃度調(diào)整到可生成長100~500個(gè)核苷酸的范圍，其他生物素酰化的核苷酸也可代替生生物素-11-dNTP。實(shí)驗(yàn)方法切口平移法隨即寡核苷酸引物合成法實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒DNA聚合酶dNTP2-疏基乙醇生物素NaClEDTASDS無水乙醇儀器、耗材注射器電泳儀離心機(jī)培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)步驟1.混合以下物質(zhì)于100μl反應(yīng)體積：（1）10μl10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ緩沖液（2）10μl0.5mmol/l3d
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04 2013年 09月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：聚合酶鏈反應(yīng)構(gòu)建重組DNA

標(biāo)簽：聚合酶重組DNA利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），任何兩個(gè)DNA片段可連接成一個(gè)新的重組DNA分子。通過在PCR引物中引入的額外非同源的核苷酸，可在連接處產(chǎn)生所需要的讀碼框架或酶切位點(diǎn)。用該技術(shù)并不需要知道待亞克隆的DNA的核苷酸序列，只需要知道兩小段伸展于片段兩倆的區(qū)段作為擴(kuò)增反應(yīng)的引物結(jié)合區(qū)。實(shí)驗(yàn)方法基本方案實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒TE無水乙醇DNA聚合酶CTP儀器、耗材電泳儀離心機(jī)PCR儀實(shí)驗(yàn)步驟1.制備模板DNA，如DNA不是經(jīng)氯化銫梯度純化的，100℃煮沸10min以滅活核酸酶。2
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04 2013年 09月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：T4 DNA聚合酶實(shí)驗(yàn)

標(biāo)簽：T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶具依賴人為模板的聚合酶活性，同時(shí)具有對單鏈、雙鏈DNA的3’到5’端的外切酶活性，缺少5’到3’端的外切酶活性。實(shí)驗(yàn)方法T4DNA聚合酶實(shí)驗(yàn)材料DNA試劑、試劑盒Trish·CldNTPMgCl2BSADTT儀器、耗材水浴鍋實(shí)驗(yàn)步驟一、50μl反應(yīng)體積：（1）50mmol/lTris·Cl，pH8.0（2）5mmol/lMgCl2（3）5mmol/lDTT（4）100μmol/l4dNTP混合液（5）50μg/mlBSA（6）0.1UT4DNA聚合酶（7）2
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22 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：瓊脂糖核酸電泳

1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般20~30ml）；3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.室溫下30~45分鐘后凝膠*凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳內(nèi)槽；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；
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22 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：基因轉(zhuǎn)染（磷酸鈣-DNA共沉淀法）磷酸鈣-DNA 共沉淀法

磷酸鈣-DNA共沉淀法核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。1、配液（1）2×HBS1.63gNaCl1.19gHepes0.023gNa2PO4、2
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22 2013年 08月: DNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)：化學(xué)法測定DNA的含量——二苯胺顯色法

（一）原理DNA在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊糖，與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，在595nm波長處有zui大吸收。DNA在40-400μg范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。（二）試劑及器材1.DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取小牛胸腺的DNA鈉鹽，以0.01mol/LNaOH溶液配成200μg/mL的溶液。2.測定樣品溶液準(zhǔn)確稱取干燥的DNA制品
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