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測序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫出了問題？！——從測序數(shù)據(jù)看文庫構(gòu)建高通量測序中的文庫構(gòu)建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測序平臺要求的過程，在高通量測序過程中，文庫質(zhì)量直接影響終測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，打個比方，如果文庫上機測序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴增所形成的DNA樣本簇就會很少，測序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導(dǎo)致測序失敗，所以我們說文庫的質(zhì)量控制和質(zhì)量評估也是NGS中的關(guān)鍵步驟。文庫如何質(zhì)控？評估文庫質(zhì)量的方法有哪些？文庫質(zhì)控：文庫在上機之前都有會進行質(zhì)量檢測，質(zhì)量檢測合格的文庫才
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實驗室常用到的實驗：逆轉(zhuǎn)錄實驗實驗人員通過體外模擬病毒復(fù)制過程，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，合成出與RNA互補的cDNA鏈。終構(gòu)建cDNA文庫，并從中篩選所需的靶標(biāo)基因。BUT！小伙伴們做逆轉(zhuǎn)錄實驗時，1）有沒有深究過RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA能不能真實反映出基因表達信息？2）做實驗時，有沒有發(fā)生過內(nèi)參做的很好，目的基因做不出的情況？如果有發(fā)生上述情況，那么需要重新評估逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果的有效性。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果有效性的評定逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果有效性的評定重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息，
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雙判定標(biāo)準(zhǔn)判定qPCR擴增特異性，提升Ct值真實性
qPCR實驗易做，但數(shù)據(jù)分析并非想象中的那么容易！數(shù)據(jù)分析的好與壞，極大程度上依賴于qPCR原始結(jié)果的質(zhì)量。qPCR結(jié)果的評價指標(biāo)?溶解曲線，是qPCR結(jié)果判定的第—要素。它的作用是判定目的基因是否得到擴增。理論上，當(dāng)反應(yīng)體系中僅是目標(biāo)基因的擴增，才是有效擴增。?標(biāo)準(zhǔn)曲線，是qPCR結(jié)果判定的金標(biāo)準(zhǔn)。（在溶解曲線判定為特異性擴增后）它的作用是測定引物的擴增效率及試劑的檢測上下限。根據(jù)文章發(fā)表對于qPCR數(shù)據(jù)的要求，擴增效率應(yīng)在90-110%。?擴增曲線，是直接生成qPCR定量的數(shù)據(jù)，即Ct值。從 -
熒光定量PCR實驗是分子實驗室常用的一項技術(shù)。持續(xù)關(guān)注小翊的應(yīng)該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法，引物設(shè)計指南以及反應(yīng)體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接），然而上機時，發(fā)現(xiàn)和別人的反應(yīng)條件不一致卻又不敢動儀器？本期小翊將帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器的設(shè)置！目前市面上的qPCR儀器種類五花八門，但基本上儀器的設(shè)置都相對一致。我們以ABI7500為例進行介紹。反應(yīng)板設(shè)置實驗?zāi)康倪x擇：我們將實驗命名為“Yeasen”，進行“Quantitation：ΔΔCt”實驗。實驗方法選擇：如選用SYBRGre
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dsDNAHSAssayKitforQubit®——給我5min，還你一個準(zhǔn)確定量結(jié)果1產(chǎn)品概述dsDNAAssayKitforQubit®是Yeasen生物開發(fā)的專門用于Qubit®熒光儀或熒光酶標(biāo)儀的試劑盒，線性范圍0.2-100ng，即使在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測dsDNA，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì)、鹽類、洗滌劑等污染物。2產(chǎn)品優(yōu)勢1）操作簡便——5min之內(nèi)出結(jié)果2）高選擇性——對dsDNA具有高度選擇性，不定量RNA和ssDNA。圖dsDNAAssa
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遺傳中心法則表明，DNA是生物體內(nèi)遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調(diào)控下從DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，再傳遞到蛋白質(zhì)。因此RNA被認為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的“橋梁”，在研究轉(zhuǎn)錄組信息中占有著重大的作用。背景介紹轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理條件下，細胞、組織或者生物體內(nèi)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，即轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同類型的RNA分子。在這之中核糖體RNA(
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RNA文庫建的好，輕松完成轉(zhuǎn)錄組測序分析不是夢
常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）主要是在轉(zhuǎn)錄水平上對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進行NGS測序，這樣可以全面快速地獲取某一物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，包括mRNA和非編碼RNA。目前轉(zhuǎn)錄組測序主流的方法是芯片法和RNA-Seq法。RNA-Seq相較于芯片法優(yōu)勢明顯，如：不受物種限制通量高靈敏度高分辨率高同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本并準(zhǔn)確地識別可變剪切位點及SNP、UTR區(qū)域等。此次疫情爆發(fā)，溯源工作主要是依靠這種方法。圖1常規(guī)RNA-Seq建庫流程精品推薦mRNA建庫試劑盒（適用Illumin -
背景介紹熒光素酶生物檢測技術(shù)誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史。單熒光素酶檢測系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴謹?shù)膶嶒炇侄巍ｋp熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結(jié)果更為可靠。其發(fā)光原理如下圖1。圖1雙熒光素酶發(fā)光原理實驗方案將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動子區(qū)克隆在Fireflyluciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)
