髓核（NP）組織是一種凝膠狀組織，主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成。髓核細胞（NPC）負責合成細胞外基質(zhì)（ECM）成分（主要是II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖），在椎間盤（IVD）退變過程中首先表現(xiàn)出細胞凋亡和/或衰老樣變化。在椎間盤退變中，衰老的NP細胞積聚并導致增殖減弱，自我修復受損，細胞功能下降以及功能性ECM破壞加劇。因此，治療IVD退變的潛在策略是通過調(diào)節(jié)退變過程中涉及的潛在信號分子或通路來減輕或延緩NP細胞的凋亡和/或衰老樣變化。

通常認為，施加在IVD上的超負荷壓縮力是導致IVD退變的主要原因。既往研究表明，由于刺激蛋白聚糖合成，生理強度的壓縮負荷（0.35-0.75 MPa）可作為NP和AF（纖維環(huán)）細胞的合成代謝因子。相反，過度壓縮（≥ 1 MPa）加重了NP和AF細胞蛋白聚糖的分解代謝。盡管NP細胞壓縮負荷相關生物行為變化的分子機制尚不清楚，但大多數(shù)研究指出，超負荷壓縮誘導的NP細胞凋亡和衰老變化與機械敏感因子（如整合素和鈣粘蛋白）觸發(fā)的細胞內(nèi)氧化損傷有關。因此，探索NP細胞壓縮相關生物學變化中潛在的生物調(diào)節(jié)因子和信號通路具有重要意義。

在重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院骨科及附屬第一醫(yī)院泌尿外科、九龍坡區(qū)第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科的一項聯(lián)合研究中，以人NP細胞作為研究對象，利用自主研發(fā)的壓縮負荷生物反應器，分析了NP細胞的凋亡和衰老樣變化；并進一步使用基于串聯(lián)質(zhì)量標簽（TMT-）的定量蛋白質(zhì)組學分析了在非壓縮，低壓縮力（LC）和高壓縮力（HC）負荷培養(yǎng)下的不同NP細胞之間的差異表達蛋白（DEPs），其中巨噬細胞移動抑制因子（MIF）和氧化應激相關通路在體內(nèi)和體外進一步評估；還建立了MIF敲除（MIF-KO）NP細胞，以進一步確定MIF在經(jīng)歷超負荷壓縮的NP細胞中的保護功能。相關內(nèi)容發(fā)表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊題為“Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy"。

該團隊之前的研究證實，機械壓縮誘導的水凝膠變形可以有效地模擬NP細胞或間充質(zhì)干細胞（MSC）的體內(nèi)負荷情況。因此，此次研究培養(yǎng)了NP細胞包裹的GelMA水凝膠，并使用自主開發(fā)的壓縮負荷生物反應器提供間歇壓縮負荷，以0%、5%、10% 和20% 的壓縮變形施加仿生壓縮力（1.0 Hz，4小時/天），處理樣本分三組：對照組-0%、LC負荷組-5%變形、HC負荷組-20%變形。

首先，研究了梯度機械壓縮對人 NP 細胞的細胞衰老、活力和 ECM 合成的影響。結果顯示，HC組（變形≥10%）陽性細胞比例顯著增加，而LC組（變形≤5%）無明顯變化。熒光活/死染色結果也表明，超過10% 的壓縮變形顯著提高了NP細胞的死亡率，而LC組并無變化。檢測細胞凋亡率的結果表明，HC組NP細胞的凋亡明顯增強，LC組則無變化。此外，衰老相關標志物（P53、P21和P16）在遭受HC負荷的NP細胞中強烈過表達，而功能性ECM成分（聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白）的合成受到HC負荷的顯著抑制，但在LC組中沒有。

為了進一步分析壓縮相關的NP細胞存活和衰老過程中的潛在功能因素，采用基于TMT的蛋白質(zhì)組學分析，分別評估了對照組、LC負荷組和HC負荷組的DEPs （圖1）。根據(jù)三組對比結果，推測LC負荷組中過表達的蛋白與HC負荷組中低表達的蛋白的交集可能是NP細胞存活的保護因子。相反，LC負荷組中低表達的蛋白與HC負荷組中過表達的蛋白的交集可能是NP細胞存活的不利因素。因此，進一步分析了蛋白質(zhì)簇，并預測了NP細胞存活的8個潛在保護因子和3個潛在有害因子。在8個潛在的保護因子中，MIF 因其在調(diào)節(jié)椎間軟骨終板（CEP）細胞命運中的作用而被選中進行進一步的研究。此外，GO和KEGG富集分析表明，壓縮負荷通過調(diào)節(jié)氧化應激相關通路（ATP生物合成過程和氧化磷酸化）影響NP細胞的命運。

圖1    TMT定量蛋白質(zhì)組學程序的流程示意圖：NP細胞包裹的水凝膠在0%（對照）、5% 變形（低壓縮負荷）和20% 變形（高壓縮負荷）的動態(tài)壓縮下培養(yǎng)2周，蛋白質(zhì)提取物用10-plex TMT試劑標記，通過LC-MS/MS分析多肽。

接下來，為了進一步驗證MIF表達與壓縮負荷相關的NP退變之間的關系，實驗建立了大鼠尾部IVD超負荷壓縮模型（圖2 a）來檢測其對大鼠尾部NP組織生物學行為及MIF表達的影響。根據(jù)先前的研究，從遠端施加軸向力產(chǎn)生1.3 MPa的壓縮負荷，然后根據(jù)壓縮持續(xù)時間將大鼠分為三組：假手術組、2周負荷組、4周負荷組。壓縮大鼠尾部IVD的圖像表明，NP組織在2周的超負荷壓縮下出現(xiàn)退變跡象，在4周的超負荷壓縮下惡化（圖2 b、c）。此外，HE染色的形態(tài)學分析還顯示壓縮大鼠尾部IVD在2周和4周內(nèi)出現(xiàn)中度和重度退行性體征（NP丟失和AF纖維軟骨薄片波紋增加）（圖2 d、e）。阿利新藍染色結果還顯示，隨著IVD壓縮時間的延長，糖胺聚糖的含量逐漸下降（圖2 f、g）。值得注意的是，MIF表達在遭受2周壓縮的中度退行性NP中上調(diào)，但在遭受4周壓縮的嚴重退行性NP中下調(diào)（圖2 h、i）。

圖2   超負荷壓縮對大鼠尾部NP生物學行為及MIF表達的影響。

基于蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)，通過分析氧化應激相關生物標志物，進一步明確MIF相關NP退行性變化的分子機制。在分析氧化應激相關生物標志物之前，敲除內(nèi)源性MIF（MIF-KO）不影響NP細胞的衰老速度，但HC負荷顯著加重了NP細胞的衰老，而MIF-KO進一步加劇了HC負荷誘導的NP細胞衰老。然后分析了NP細胞中細胞內(nèi)ROS含量，結果表明，單獨敲除MIF不會誘導ROS的積累。然而，HC負荷確實增加了NP細胞中ROS的含量，并且MIF-KO顯著增加了HC負荷處理的NP細胞中ROS的含量。此外，MIF-KO顯著消除了MIF的表達，但衰老相關標志物（P53、P21和P16）和氧化應激相關標志物（NT）的表達不受MIF-KO的影響。與對照組相比，HC負荷降低了MIF的表達，顯著增強了P53、P21、P16和NT的表達。同樣，HC負荷處理的NP細胞中MIF的敲除進一步加劇了衰老相關和氧化應激相關標志物的表達。這些數(shù)據(jù)表明，MIF的缺失加劇了遭受超負荷壓縮的人類NP細胞中氧化應激誘導的衰老。

線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場所，也是ROS的主要產(chǎn)生部位。之前的研究證實，線粒體自噬可以通過回收受損的線粒體來緩解氧化應激誘導的NP細胞衰老。因此，實驗最后在當前研究的基礎上進一步觀察了線粒體自噬相關的標記。

蛋白質(zhì)印跡結果表明，MIF-KO和HC處理均能下調(diào)PINK1和LC3II/I的表達，上調(diào)Parkin 和P62的表達，這是線粒體自噬阻斷的標志（圖3 a、b）。值得注意的是，HC處理的NP細胞中MIF的敲除進一步加劇了線粒體自噬相關標志物的抑制（圖3 a、b）。JC-1染色結果表明，單獨敲除MIF不會引起線粒體損傷，但HC負荷加重了NP細胞線粒體損傷（圖3 c、d）。此外，HC處理的MIF-KO NP細胞具有最高的JC-1綠/紅色熒光比，表明MIF的缺失加劇了HC負荷誘導的受損線粒體的積累（圖3 c、d）。

為了進一步研究不同階段的線粒體自噬，用編碼GFP-LC3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NP細胞，分別標記自噬體和線粒體，觀察NP細胞中線粒體和自噬體的數(shù)量和形態(tài)。對照組和MIF-KO組NP細胞的線粒體保持正常的形態(tài)和結構，而在HC負荷處理的NP細胞中，線粒體明顯wei;suo，膜密度增加。此外，HC負荷的細胞在其細胞質(zhì)中表現(xiàn)出更多的自噬體，而用HC負荷的MIF-KO NP細胞在其細胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)典型的自噬體。上述結果表明，MIF的缺失確實延緩了NP細胞的線粒體自噬，從而加劇了超負荷壓縮下氧化應激誘導的NP細胞的衰老。

圖3   MIF-KO加劇氧化應激誘導的NP細胞衰老和線粒體功能障礙。

圖4    MIF調(diào)控超負荷壓縮誘導的NP細胞衰老的潛在機制：超負荷壓縮誘導線粒體損傷，觸發(fā)NP細胞氧化應激相關衰老。MIF的缺失抑制了NP細胞的線粒體自噬，這進一步加劇了超負荷壓縮力下NP細胞氧化應激相關的衰老。

總之，該研究表明，超負荷的機械壓縮會導致人類NP細胞的氧化應激、線粒體功能障礙和退行性變化。相反，適當?shù)纳韷嚎s力有利于維持NP的細胞活力和ECM穩(wěn)態(tài)。此外，MIF表達與NP細胞的機械壓縮力相關的生物學變化之間存在一定的關系。MIF的缺失加劇了超負荷機械壓縮下ROS的積累，線粒體功能障礙和衰老。該過程涉及的潛在分子機制與MIF的線粒體自噬誘導作用有關。該研究有助于我們更好地理解機械壓縮應力在椎間盤退變過程中的調(diào)節(jié)作用，為使用MIF治療椎間盤退行性疾病提供了更有力的證據(jù)。

參考文獻：Wang Y, Hu Y, Wang H, Liu N, Luo L, Zhao C, Zhou D, Tong H, Li P, Zhou Q. Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy. Oxid Med Cell Longev. 2021 Jul 1;2021:6192498. doi: 10.1155/2021/6192498. PMID: 34306312; PMCID: PMC8270705.

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