肺動脈外膜成纖維細(xì)胞（PAAFs）對血管細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）穩(wěn)態(tài)和重塑很重要，有證據(jù)表明PAAFs受基質(zhì)剛度、拉伸應(yīng)力或過度拉伸損傷和缺氧的調(diào)節(jié)。在損傷期間，PAAFs被激活并分化為肌成纖維細(xì)胞亞型，通過直接改變ECM蛋白（包括膠原蛋白，纖連蛋白和彈性蛋白）的表達(dá)、降解或交聯(lián)來重塑血管壁特性。鑒于ECM也可作為細(xì)胞粘附的基質(zhì)，并發(fā)送決定細(xì)胞表型的物理和化學(xué)線索，因此有人認(rèn)為基質(zhì)變硬可能預(yù)示著組織重塑，并且是肺動脈高壓的致病驅(qū)動因素。

肺動脈高壓（PAH）是一種血管病變，表現(xiàn)為肺動脈壓持續(xù)升高、血管收縮和不可逆的血管重塑。肺動脈壁外膜中的PAAFs對變化的機(jī)械條件和功能作出反應(yīng)，重塑ECM，從而調(diào)節(jié)其機(jī)械特性。雖然成纖維細(xì)胞活化誘導(dǎo)血管膠原基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但尚不清楚PAAFs如何受到基質(zhì)組成和剛度的調(diào)節(jié)，如何受到PAH期間負(fù)荷增加引起的血管拉伸改變的影響，以及哪些信號通路調(diào)節(jié)這些對物理刺激的表型反應(yīng)。

為了更好地識別PAH期間調(diào)控PAAFs反應(yīng)的受體和通路，美國加州大學(xué)圣地亞哥分校生物工程系的研究團(tuán)隊(duì)曾構(gòu)建了PAAFs的機(jī)械信號模型，并對不同剛度凝膠和不同拉伸條件下培養(yǎng)的PAAFs進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，以確定六個促纖維化基因?qū)δMPAH輕度和重度階段的拉伸和剛度變化的反應(yīng)。該分析表明，細(xì)胞拉伸和ECM剛度變化差異激活的通路可能有助于闡明PAAFs中組織重塑的順序。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 CELLS期刊題為“Substrate Stiffness and Stretch Regulate Profibrotic Mechanosignaling in Pulmonary Arterial Adventitial Fibroblasts"。

PAAFs 上調(diào)促纖維化基因以響應(yīng)基質(zhì)剛度和拉伸增加

實(shí)驗(yàn)使用對應(yīng)于正常血壓的肺動脈（0.5 kPa）、輕度PAH（3 kPa）和重度PAH（10 kPa）的硬度制備聚丙烯酰胺水凝膠，模擬體內(nèi)不同階段的物理基質(zhì)剛度。PAAFs在0.5 kPa剛度6孔板上培養(yǎng)三天后從肌成纖維細(xì)胞恢復(fù)為成纖維細(xì)胞表型，與在較硬的基質(zhì)上生長的細(xì)胞相比，Acta2的表達(dá)降低，培養(yǎng)時呈圓形（圖1 B），而在較硬的基質(zhì)上生長的細(xì)胞則呈星狀，Acta2表達(dá)較高（圖1 C、D）。在0.5 kPa底物上培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中Col1a1，Col3a1，Eln，F(xiàn)n1，Loxl1和Acta2基因的信使RNA水平與從正常血壓大鼠的肺動脈外膜中提取的RNA水平?jīng)]有顯著差異（圖1 A）。這表明，在0.5 kPa基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞可以模擬以下研究中六個基因在體內(nèi)PAAFs中的表達(dá)。

與在0.5 kPa底物上培養(yǎng)的PAAFs中的mRNA水平相比，六個基因均響應(yīng)基質(zhì)剛度的增加而顯著上調(diào)。Acta2和Loxl1的表達(dá)在3 kPa基質(zhì)生長的細(xì)胞上明顯更高，但在10 kPa基質(zhì)生長的細(xì)胞上不顯著，與0.5 kPa基質(zhì)相比（圖1 A），Col1a1、Col3a1、Eln和Fn1在10 kPa基質(zhì)上顯著上調(diào)（與晚期PAH中的動脈硬度相當(dāng)）。有趣的是，Acta2和Loxl1的表達(dá)表現(xiàn)出非單調(diào)效應(yīng)，與0.5 kPa基質(zhì)相比，3 kPa基質(zhì)上的基因表達(dá)顯著上調(diào)，但在0.5 kPa和10 kPa基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞之間沒有顯著差異。

圖1     基質(zhì)剛度對肺動脈內(nèi)皮成纖維細(xì)胞（PAAF）分化的影響。

檢查六個基因在10% 等雙軸拉伸24小時的PAAFs中的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖2 A-F），與未拉伸細(xì)胞相比，Col1a1、Col3a1、Eln、Loxl1 和 Acta2 顯著上調(diào)，而不依賴于基質(zhì)剛度。 雖然Fn1表達(dá)在拉伸24小時后沒有顯著變化（圖1 A），但在所有凝膠剛度下，F(xiàn)n1表達(dá)在4小時后都顯著上調(diào)。另一方面，Col1a1僅在拉伸24小時后顯著上調(diào)，但在4小時后沒有。這表明Fn1是由短時間的拉伸短暫誘導(dǎo)的，而Col1a1對拉伸的反應(yīng)要慢得多。這一發(fā)現(xiàn)與將Fn1確定為早期反應(yīng)基因的報道一致。在六個基因的表達(dá)中沒有發(fā)現(xiàn)基質(zhì)剛度和拉伸之間的顯著交互作用。

根據(jù)事后測試，在3 kpa和10 kpa時，ECM剛度的增加顯著上調(diào)了III型膠原蛋白和平滑肌肌動蛋白（SMA）的表達(dá)。這與膠原蛋白III（Col3a1）和SMA（Acta2）的RNA相對表達(dá)一致，如圖1 B、F，從0.5 kPa-3 kPa 顯著增加，而從3 kPa-10 kPa沒有進(jìn)一步顯著增加。

圖2    剛硬和拉伸對肺動脈內(nèi)皮成纖維細(xì)胞（PAAFs）基因表達(dá)的影響。

PAAF網(wǎng)絡(luò)模型模擬剛度和拉伸激活的基因表達(dá)

該模型預(yù)測，基質(zhì)剛度從0.5 kPa增加到3或10 kPa 時，所有六個基因都會顯著上調(diào)（圖3）。這些模型的預(yù)測與實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果相符，即所有六個基因在較硬基質(zhì)上生長的細(xì)胞中都顯著上調(diào)。

該模型還預(yù)測了在 10% 等雙軸拉伸誘導(dǎo)24小時后，Col1a1，Col3a1，Loxl1和Acta2的基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)n1表達(dá)恢復(fù)到基線水平。然而，該模型預(yù)測Eln表達(dá)隨拉伸而下調(diào)，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)。雖然該模型與數(shù)據(jù)在定性上一致，但它并沒有概括Loxl1和Acta2的非單調(diào)效應(yīng)（圖1 A）。

圖3    由于拉伸和剛度引起的基因活性的實(shí)驗(yàn)觀察（Expt）與模型預(yù)測（模型）的比較。

血管緊張素 II 受體抑制揭示了剛度和拉伸對纖連蛋白基因表達(dá)的相互作用

基于敏感性分析，實(shí)驗(yàn)?zāi)M了模型中三個力學(xué)敏感節(jié)點(diǎn)（AT1、TGF-β、MST1/2）抑制劑存在時拉伸和剛度增加的影響。圖4 顯示了抑制AT1、TGF-β 和 MST1/2 對基質(zhì)剛度從 0.5-3 kPa 增加以及拉伸引起的基因表達(dá)變化的影響。

圖4   由抑制血管緊張素II受體I型（AT1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和巨噬細(xì)胞刺激1或2（MST1/2）受體對剛度和拉伸的反應(yīng)而引起的基因表達(dá)變化。

從模型模擬中可以看出，基質(zhì)剛度增加對Loxl1表達(dá)的誘導(dǎo)是由MST1/2信號通路特異性調(diào)控的，而其他5個基因?qū)偠鹊姆磻?yīng)均被阻斷TGF-β受體顯著抑制。AT1 受體抑制顯著減弱了Col1a1、Col3a1、Fn1和Acta2的剛度依賴性誘導(dǎo)，但對Eln或Loxl1無顯著影響，且抑制幅度明顯小于阻斷TGF-β受體時。在增加基質(zhì)剛度的模型中阻斷血管緊張素信號使膠原蛋白下調(diào)20%，阻斷TGF-β信號使膠原蛋白下調(diào)30%，而阻斷血管緊張素使Acta2下調(diào)17%，阻斷TGF-β使其下調(diào)86%（圖4）。

在施加拉伸刺激的同時阻斷模型中的TGF-β信號抑制了Acta2的上調(diào)，并下調(diào)Eln。拉伸誘導(dǎo)的Col1a1和Col3a1通過抑制MST1/2和血管緊張素II信號而降低，而拉伸對Loxl1的調(diào)節(jié)僅通過抑制MST1/2受到影響。Fn1表達(dá)未因拉伸而顯著改變，在所有三種抑制劑存在下均保持不變。這與它對基質(zhì)剛度的響應(yīng)形成鮮明對比，其中抑制AT1 和TGF-β受體具有顯著作用（圖4）。

由于該模型表明血管緊張素II信號在調(diào)節(jié)Fn1表達(dá)以響應(yīng)剛度增加而不是拉伸時發(fā)揮重要作用（圖4、圖5 B），因此用1 M氯沙坦（一種AT1受體阻滯劑）處理培養(yǎng)的PAAFs。

與0.5 kPa相比，氯沙坦消除了3 kPa基質(zhì)對纖連蛋白mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)，并且在0.5 kPa基質(zhì)上生長的PAAFs中的Fn1表達(dá)在24 h后仍然對拉伸無反應(yīng)（圖5 A）。當(dāng)血管緊張素II信號被阻斷時，拉伸顯著上調(diào)了生長在較硬的3 kPa基質(zhì)上的PAAFs Fn1的表達(dá)。

圖5 A中各實(shí)驗(yàn)條件下Fn1表達(dá)對剛度、拉伸和AT1受體抑制增加的響應(yīng)模型模擬如圖5 B所示。該模型概括了對照條件和當(dāng)基質(zhì)剛度從0.5 kPa增加到3 kPa時纖連蛋白mRNA的增加，以及Fn1在3 kPa基質(zhì)上對拉伸誘導(dǎo)的定性響應(yīng)。該模型還正確預(yù)測了在拉伸和未拉伸條件下，氯沙坦對拉伸24小時后0.5 kPa基質(zhì)上的Fn1 mRNA水平?jīng)]有影響。然而，雖然在體外觀察到氯沙坦通過增加未拉伸的PAAFs的剛度來抑制Fn1上調(diào)，但該模型無法重現(xiàn)這一觀察結(jié)果。

圖5   使用和不使用AT1受體抑制劑氯沙坦時，纖維連接蛋白基因表達(dá)對基質(zhì)剛度增加和10%等雙軸拉伸的反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)觀察。

總之，使用各種剛度的水凝膠底物在細(xì)胞拉伸裝置中的體外實(shí)驗(yàn)表明，PAAFs對促纖維化基因的表達(dá)受細(xì)胞拉伸和細(xì)胞外基質(zhì)剛度的差異調(diào)控。對于這里研究的六個基因，沒有觀察到拉伸和剛度之間的相互作用效應(yīng)，然而，AT1受體阻斷發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在堅(jiān)硬而不是柔軟的基質(zhì)上生長時，通過拉伸，PAAFs中血管緊張素不依賴于Fn1表達(dá)的激活。響應(yīng)改變的機(jī)械條件的PAAF促纖維化細(xì)胞信號的體外和計(jì)算機(jī)模型的新組合可能有助于識別血管外膜重塑的調(diào)節(jié)因子，這種調(diào)節(jié)因子是由體內(nèi)PAH進(jìn)展期間發(fā)生的拉伸和基質(zhì)剛度的變化引起的。

參考文獻(xiàn)：Wang A, Cao S, Stowe JC, Valdez-Jasso D. Substrate Stiffness and Stretch Regulate Profibrotic Mechanosignaling in Pulmonary Arterial Adventitial Fibroblasts. Cells. 2021 Apr 23;10(5):1000. doi: 10.3390/cells10051000. PMID: 33922850; PMCID: PMC8146344.

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