細胞株污染是世界細胞庫面臨且長期存在的一大問題。每年都會由于細胞污染導(dǎo)致數(shù)萬美元的損失。

而在這些污染之中, 支原體污染是首要威脅。支原體是廣泛存在于自然界中能獨立生活的zui小微生物, 直徑300~800 nm, 能在細胞內(nèi)繁殖, 且細胞壁的缺乏使其對常見抗生素如青霉素和鏈霉素具有更高的耐受性, 其靈活、小規(guī)模和多態(tài)性使它更容易透過0.22~0.45 μm濾膜。自1956年Robinson等*次報道支原體污染以來, 世界各地實驗室細胞庫開始重視并檢測細胞中是否存在支原體污染。有文獻指出, 細胞培養(yǎng)過程中, 支原體感染發(fā)生率高達30%~60%。因此, 及時、準(zhǔn)確地檢測出所培養(yǎng)的細胞是否有支原體污染至關(guān)重要。污染細胞的支原體主要有人源、豬源和牛源三類, 大部分是發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentants)、豬鼻支原體(M. hyorhinis)、口腔支原體(M. orale)、精氨酸支原體(M. arginini)、梨支原體(M. pirum)、唾液支原體(M. salivarium)、萊氏無膽甾支原體(Acholeplasmalaidlawii)和人型支原體(M. hominis)。

支原體污染會影響細胞的形態(tài)、功能、代謝、細胞膜、生長速率、誘導(dǎo)染色體畸變、細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等各種細胞特性。受支原體污染的細胞在培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值不會發(fā)生改變, 也不會渾濁,因此, 很難直接觀察出細胞是否受到污染。常用的支原體檢測方法有培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、酶聯(lián)免疫吸附法和PCR法等。

1. 培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是zui傳統(tǒng)的檢測方法, 該方法能直觀地顯示是否存在支原體污染。將細胞培養(yǎng)物置于PPLO肉 湯 培 養(yǎng) 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培養(yǎng)3天后離心, 將沉淀物轉(zhuǎn)移至PPLO瓊脂培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)4~6周, 觀察是否有“煎雞蛋”樣菌落出現(xiàn), 若有即為支原體污染。

這種方法簡單易行, 但耗時比較長, 且存在不少缺陷。支原體由于遺傳缺陷, 導(dǎo)致某些代謝途徑缺失, 其生長很大程度依賴于培養(yǎng)基的成分。在
配制培養(yǎng)基時, 任何成分質(zhì)量或批次的不同都會影響支原體的生長, 從而影響檢測的靈敏度。不同的生長條件(如好氧、厭氧、微氧等)也會影響檢測結(jié)果, 易導(dǎo)致假陽性。此外, 還有許多支原體無法培養(yǎng), 因此, 使用培養(yǎng)法的檢測結(jié)果并不全面。

2. DNA熒光染色法

DNA熒光染色法是基于使用熒光染料DAPI或Hoechst 33258的細胞化學(xué)染色法。熒光染料能選擇性的結(jié)合細胞和支原體DNA的小溝, 因此, 細胞株在準(zhǔn)備過程中, 任何存在的DNA均會被染色且DNADAPI復(fù)合物吸收波長為340~488nm。將待測細胞單層培養(yǎng)至70%~90%匯合度時, 用細胞刮刀收取, 以5×104/mL~1×105/mL濃度轉(zhuǎn)接至蓋玻片上培養(yǎng)12~24小時, 用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分鐘, 無菌水洗滌
并烘干后置于檸檬酸緩沖液(pH5.5)?甘油(2?1)條件中, 用指甲油密封。處理后的玻片置于熒光顯微鏡下觀察, 被支原體污染的細胞經(jīng)染色后, 細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一的熒光點。
常溫，避光    UV法含量測定    *：    萘普生    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測定    *：    潑尼松    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測定    *：    青蒿琥酯    規(guī)格:    50mg
常溫，避光    含量測定    *：    氫溴酸右美沙芬    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    UV法含量測定    *：    舒必利    規(guī)格:    100mg
常溫，避光    含量測定    *：    沙丁胺醇    規(guī)格:    100mg
細胞株