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上海徠同生物科技有限公司

細胞凋亡檢測實驗原理

時間:2022-8-18閱讀:93
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技術原理

細胞凋亡是細胞的基本特征,在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。

在正常的活細胞中,磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于細胞膜的內側,但在早期凋亡的細胞中,PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力結合,可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI是一種核酸染料,它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜,但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此,將Annexin V與PI聯合使用時,PI 則被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現雙陽性(Annexin V+/PI+)。

實驗方法

Step1:細胞培養(yǎng)

Step2:轉染或藥物處理

Step3:細胞收集

Step4:加凋亡試劑

Step5:上機檢測

案例展示

技術總結

1、考慮到進行流式時需要用到對照組細胞設置空白組(用于調節(jié)電壓)和單染組細胞(用于調節(jié)補償),因此要求該組細胞量較其他組多

2、如發(fā)現細胞密度偏低,細胞量較少,則適當增加離心時間。收集細胞時,應該連同上清一起收集,同時胰酶消化時間不宜過長,否則容易引起假陽性

3、檢測細胞經過轉染等處理后可能會帶有自發(fā)熒光,應注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如:帶綠色熒光時,應選擇7AAD試劑盒

4、細胞鋪板應選擇細胞狀態(tài)良好的時候進行,且避免反復吹打

5、流式檢測細胞樣本:細胞樣品準備時,使用不含EDTA的胰酶消化細胞,不得使用細胞刮刀進行操作,胰酶消化細胞時切忌消化過頭或沒有打開細胞間隙



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