2025版《中國藥典》解讀 | “分子學解碼"第二期：實時熒光定量PCR新規(guī)解讀

分子學解碼

實時熒光定量PCR新規(guī)

修訂解讀

隨著《中國藥典》1001 聚合酶鏈式反應(yīng)法修訂稿的公示，實時熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)正式成為藥品質(zhì)量控制的關(guān)鍵手段之一。

PART 1

新規(guī)聚焦：藥典第二法實時熒光定量 PCR 核心要求

《中國藥典》1001聚合酶鏈式反應(yīng)法修訂稿系統(tǒng)性地引入了第二法：實時熒光定量PCR法（Real-time qPCR），明確了其在藥品質(zhì)量控制中的重要地位，尤其適用于：

●  定性/定量檢測： 動/植物源性中藥材、飲片、原材料、中間體、原料藥、輔料及生物制品中的特定核酸成分。

●  關(guān)鍵應(yīng)用： 種屬鑒定、雜質(zhì)殘留檢測、基因表達分析等。

為了確保結(jié)果的準確性和可靠性，新規(guī)對實時熒光定量PCR法提出了嚴格的技術(shù)要求：

1.儀器要求

●  具備精確的溫度控制能力（變性、退火/延伸等步驟）。

●  需配置與檢測要求相匹配的熒光激發(fā)與信號讀取模塊（支持染料法或探針法）。

2.試劑要求

●  核心組分：耐熱 DNA 聚合酶、緩沖液、dNTP、引物、模板。

● 探針法需熒光標記探針，染料法需合適的熒光染料。

●  試劑需經(jīng)驗證或質(zhì)量確認（自制、商品化試劑或?qū)Ｓ迷噭┖校?/span>使用過程嚴防污染。

●  RNA 檢測需特別注意無 RNase 環(huán)境和快速滅活 RNA 酶。

3.測定法核心流程

●供試品前處理： 按品種要求進行（同第一法常規(guī) PCR）。

●嚴格的對照設(shè)置：

? 陽性對照： 含目標片段且與樣品類型一致（定量時濃度/拷貝數(shù)需確認）。

? 加標對照： 加入陽性對照的待測樣品，驗證回收率。

? 陰性對照： 不含目標片段且與樣品類型一致。

●模板制備：

? DNA 提取質(zhì)量要求（OD260/OD280: 1.5-2.5； OD260/OD230: 2-3）。

? RNA 提取要求更高（OD260/OD280: 1.8-2.1； OD260/OD230 ≥ 1.7），需逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

●引物與探針： 序列按品種/通則規(guī)定。

●核酸擴增： 反應(yīng)體系組成、循環(huán)程序需符合規(guī)定，探針法需讀取延伸后熒光，染料法需進行熔解曲線分析。

● 數(shù)據(jù)獲?。?/span> 設(shè)定合理的熒光閾值（Ct值）。

● 系統(tǒng)適用性要求：

? 標準曲線： 至少 5 個對數(shù)級濃度梯度。擴增效率(E%)必須達到 85%-110%（斜率Slope: -3.10 ~ -3.74）。決定系數(shù)（R2）**≥ 0.98**。

? 對照組： 陽性對照必須為陽性；加標對照回收率 50%-150%；陰性對照應(yīng)無 Ct 值或 Ct 值不低于濃度標準品。

? 重復(fù)性： 陽性對照及樣品復(fù)孔的 RSD ≤ 30%。

? 熔解曲線（染料法）： 陽性對照及標準品熔解曲線需為單一尖銳峰，待測樣品Tm值需符合規(guī)定。

? 數(shù)據(jù)分析： 支持定性、絕對定量和相對定量分析（需內(nèi)參基因歸一化）。

4.方法驗證要求

● 新方法需進行系統(tǒng)驗證，驗證指標（專屬性、準確度、精密度、線性、范圍、檢測限等）需與方法用途匹配。

5.實驗室環(huán)境要求

●  需符合國家生物安全管理要求。

●  嚴格分區(qū)（試劑配制、模板制備、擴增、產(chǎn)物分析），嚴防交叉污染。

●  推薦參照 CNAS-GL029《基因擴增領(lǐng)域檢測實驗室認可指南》 等規(guī)范進行管理。

總結(jié)新規(guī)關(guān)鍵點： 高精度溫控、穩(wěn)定熒光檢測、嚴格系統(tǒng)適用性（效率、線性、重復(fù)性、熔解曲線）、合規(guī)實驗室管理是成功實施藥典實時熒光定量PCR法的核心要素。

PART 2

賽默飛 QuantStudio：滿足藥典嚴苛要求的完整 qPCR 解決方案

面對《中國藥典》對實時熒光定量 PCR 提出的高要求、高標準，賽默飛世爾科技提供全系列的 QuantStudio™ 實時熒光定量 PCR，助您輕松合規(guī)，結(jié)果精準！

賽默飛QutantStudio qPCR

系統(tǒng)關(guān)鍵特性對比表

PART 3

應(yīng)用場景：QuantStudio 助力藥品全流程質(zhì)控

● 中藥材/飲片種屬鑒定： 利用探針法定量特異性 DNA 片段，準確鑒別烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇、川貝母、霍山石斛等，以及豬、牛、羊源性成分。

● 原材料/輔料溯源與污染監(jiān)控： 檢測動植物源性原料真實性，監(jiān)控微生物污染（如支原體）。

●生物制品宿主殘留 DNA 檢測： 高靈敏度定量生產(chǎn)過程中殘留的宿主細胞 DNA。

● 基因工程藥物質(zhì)量評價： 分析治療性蛋白的表達水平。

●  方法開發(fā)與驗證： QuantStudio系列產(chǎn)品的高性能和靈活性是開發(fā)和驗證符合藥典要求的新qPCR方法的可靠平臺。

《中國藥典》1001 通則對實時熒光定量 PCR 法的規(guī)范化，標志著藥品核酸檢測邁入新階段。賽默飛世爾科技 QuantStudio 系列實時熒光定量 PCR 系統(tǒng)，憑借其性能、靈活的配置、強大的合規(guī)性支持以及完善的服務(wù)，是您應(yīng)對新規(guī)挑戰(zhàn)、提升藥品檢測能力、確保結(jié)果精準合規(guī)的值得信賴的合作伙伴。

尾聲

我們將對整個藥典第四部與分子學相關(guān)的內(nèi)容進行解析，歡迎大家繼續(xù)關(guān)注！

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