檢測(cè)干細(xì)胞四唑鹽比色法試驗(yàn)原理
此法的原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中，而干細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)，以在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞使其成為單細(xì)胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基配成1x10^9個(gè)/L的但細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul。
●將培養(yǎng)板置CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)3-5天。
●培養(yǎng)3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3-6h，終止培養(yǎng)，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，將細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周圍的MTT顆粒充分溶解。
●用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔吸光度（OD），選波長(zhǎng)490nm。以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
用此法測(cè)干細(xì)胞活力，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在試驗(yàn)前測(cè)定每種細(xì)胞的貼比率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，再確定每孔細(xì)胞接種數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止時(shí)不會(huì)過(guò)滿。另外，實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)空白對(duì)照，比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。
3.2.2 CCK-8 法
Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。
● 制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)
● 接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。
● 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。
●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
●培養(yǎng)1-4小時(shí):干細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)*條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。
●測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。