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胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程

來(lái)源:上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司   2010年12月29日 17:03  

                        胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程

維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài):

ES細(xì)胞培養(yǎng)用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養(yǎng)基來(lái)阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2-3天從達(dá)到80%-90%融合的平板按1:8的比率傳代細(xì)胞一次,細(xì)胞傳代以后,在將細(xì)胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前,通過(guò)預(yù)先將細(xì)胞接種在沒(méi)有經(jīng)過(guò)包被的組織培養(yǎng)板2個(gè)小時(shí),使分化細(xì)胞粘附,從而將分化和未分化細(xì)胞分開(kāi)。將細(xì)胞全程置于37℃,5%CO2,100%濕度條件下培養(yǎng)。


培養(yǎng)基:ES:配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見(jiàn)下文)。分裝在50ml FALCON管中,(稀釋為2×,每管42ml),貯存在-20℃。通過(guò)將21ml該溶液,HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基,0.2μm濾膜過(guò)濾。貯存于4℃。
注:一瓶DMEM是500ml。


貯存液:DMEM(高糖)、馬血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巰基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。
復(fù)蘇細(xì)胞:細(xì)胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結(jié)晶的形成,結(jié)晶的形成會(huì)損害細(xì)胞。然而,二甲基亞砜對(duì)細(xì)胞有毒性,快速的進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。


操作步驟:
1.從液氮中取出一管細(xì)胞;
2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內(nèi)溶液恰好*溶解);
3.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中;
4.加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管);
5.離心3分鐘;
6.棄上清,用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,至少吹打10次;
7.接種在明膠包被(見(jiàn)下文)的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿;
8.孵育。


凍存細(xì)胞
凍存液:90%HS和10%二甲基亞砜
步驟:
1.1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi);
2.用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞;
3.將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml Falcon管內(nèi)并離心3分鐘;
4.棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml,15cm的培養(yǎng)皿用6-7ml。)
5.分裝于凍存管內(nèi),每管1ml;
6.置-80℃過(guò)夜,第二天移入液氮。


明膠包被:準(zhǔn)備500ml 0.1%明膠溶液
1.將0.5g明膠溶解在500ml無(wú)鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15~30分鐘)。
2.在溶液沒(méi)有冷卻的情況下通過(guò)0.2μm濾膜過(guò)濾,貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1.加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面(15cm培養(yǎng)皿加2ml,10cm培養(yǎng)皿加0.5~1ml,溶液的量并不重要,只要能*覆蓋培養(yǎng)表面就行了。);
2.置室溫30分鐘;
3.去除明膠溶液,將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置,將板子平方,以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。

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