如何解決技術(shù)難題
如何解決技術(shù)難題 且看五個(gè)科學(xué)實(shí)例
隨著對(duì)細(xì)胞生理研究的逐漸深入,科學(xué)家們開(kāi)始解析單個(gè)細(xì)胞的行為,這是因?yàn)榧词故峭瑯拥倪z傳物質(zhì),同樣的周邊環(huán)境,這些細(xì)胞還是會(huì)朝著不同的方向發(fā)展,有時(shí)還會(huì)生成不同的功能,而且單個(gè)細(xì)胞的變化還關(guān)系到癌癥,神經(jīng)疾病等疾病。www.runwelltac.com
然而要分析單個(gè)細(xì)胞,卻不是那么容易的事情,在基因表達(dá)分析中占據(jù)主要位置的DNA芯片這種分析方法,由于靈敏度不夠,所以不足以發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞水平上的差異,但是從單個(gè)細(xì)胞中挑選少量RNAs,或者蛋白也不容易做到,而且如果還要分析細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)因素,那就不只是繁瑣實(shí)驗(yàn)的問(wèn)題,還需要物理學(xué),機(jī)械學(xué),和生物學(xué)的多方配合。為了解決這些問(wèn)題,五位科學(xué)家分別采用了不同的方法,為研究人員提供了新思路。
細(xì)胞信號(hào)交流調(diào)控著基本的細(xì)胞活性以及人體中相應(yīng)的細(xì)胞活動(dòng)。細(xì)胞準(zhǔn)確應(yīng)答周圍環(huán)境的能力是發(fā)育、組織修復(fù)和免疫的基礎(chǔ)。深入理解細(xì)胞間的相互交流將有助于了解生物系統(tǒng)的復(fù)雜性,或能開(kāi)發(fā)出癌癥,糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。
因此Quake研究組研發(fā)了一種新方法來(lái)觀察單一細(xì)胞在細(xì)胞信號(hào)復(fù)雜系統(tǒng)中的應(yīng)答反應(yīng),這種方法就是高通量的微流體細(xì)胞培養(yǎng)(high-throughput microfluidic cell culture),將這一技術(shù)與熒光顯微鏡,定量基因表達(dá)分析和建立數(shù)學(xué)模型等研究手段結(jié)合起來(lái),Quake研究組發(fā)現(xiàn)相同細(xì)胞之間存在大范圍的差異,并且指出了科學(xué)家的一些認(rèn)識(shí)可能已經(jīng)被基于細(xì)胞群體研究的結(jié)果所誤導(dǎo)。
細(xì)胞活化這一結(jié)果是一樣的,然而細(xì)胞達(dá)到結(jié)果的過(guò)程可能是不一樣的,群體研究不能顯示信息錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的差異,而這在單一細(xì)胞水平中可以觀察到。
研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細(xì)胞,這些濃縮物是免疫系統(tǒng)應(yīng)答炎癥或癌癥反應(yīng)的代表性物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一些細(xì)胞接受信號(hào)并被激活,而一些細(xì)胞則沒(méi)有激活。研究人員人員觀察到細(xì)胞以不同的方式產(chǎn)生應(yīng)答,但是細(xì)胞的基本反應(yīng)在許多方面是一致的。
這種方法的優(yōu)勢(shì)是效率十分高——利用這種方法,研究人員能同時(shí)處理成百上千的細(xì)胞,并且觀察長(zhǎng)達(dá)4天的時(shí)間里,這些細(xì)胞的反應(yīng)。而缺點(diǎn)就是微流體實(shí)驗(yàn)并不容易操作,因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測(cè)細(xì)胞對(duì)于一個(gè)信號(hào)刺激的反應(yīng),那么也許一個(gè)96孔板就能搞定,但是如果你希望了解細(xì)胞在系列環(huán)境中的反應(yīng),那么微流體實(shí)驗(yàn)也許更加合適,具體來(lái)說(shuō)還得看個(gè)人的情況。
在這項(xiàng)研究中,Wickramasinghe教授采用了一種新方法來(lái)處理mRNA,這種方法主要借助于一種十分精巧,稱為介電納米探針(dielectrophoretic nanoprobes,生物通譯)的探針,這種探針表面帶有特異性mRNA的引物。當(dāng)這種探針的針尖(20nm)通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候,就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)電場(chǎng),吸引細(xì)胞核內(nèi)的分子,這樣探針收回來(lái)的時(shí)候,研究人員就能計(jì)算這一mRNA選擇性“釣”到的分子,比如在Wickramasinghe教授這一實(shí)驗(yàn)中,就是癌基因表達(dá)相關(guān)的分子。
Wickramasinghe教授認(rèn)為這種方法中細(xì)胞不會(huì)死亡,從而研究人員之后還能向其注入試劑,讓這一基因沉默,一個(gè)星期之后又能實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的具體變化了。
這一方法的優(yōu)點(diǎn)就是相對(duì)于其它基因組分析方法,這一方法不會(huì)破壞細(xì)胞,能進(jìn)行進(jìn)一步分析,而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程時(shí)間短——整個(gè)過(guò)程大約只需要幾分鐘。缺點(diǎn)就在于這些細(xì)胞必需是自然貼壁的,如果像成纖維細(xì)胞那樣,就要增加一步步驟進(jìn)行處理。不過(guò)Wickramasinghe教授提出也許可以在浸泡在一種細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)物中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
維吉尼亞州大學(xué)的Martin Schwartz教授研究組為此發(fā)明了一種傳感器,這種生物傳感器能在活體中測(cè)量蛋白所承受力,研究人員利用這一傳感器發(fā)現(xiàn)了粘著斑蛋白承受力的奧秘。
細(xì)胞對(duì)物理力量做出響應(yīng)的能力對(duì)于發(fā)育和生理來(lái)說(shuō)都是根本性的,包括血液、細(xì)胞粘附和遷移的調(diào)控。難以對(duì)活體細(xì)胞中的分子力進(jìn)行測(cè)量的難度限制了對(duì)此現(xiàn)象的研究。
新開(kāi)發(fā)的這種傳感器就是一種基因編碼的熒光張力感應(yīng)模塊,該模塊能夠在活體中測(cè)量穿過(guò)特定蛋白的機(jī)械力。研究人員利用這種傳感器對(duì)粘著斑蛋白進(jìn)行了測(cè)試——粘著斑蛋白是一種膜-細(xì)胞骨架蛋白,它被吸引到粘著斑上,并將細(xì)胞粘附分子(整合素)與肌動(dòng)蛋白細(xì)絲相連。結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)粘著斑蛋白承受力的能力決定粘著斑在力的作用下是整合還是分解。
這種新型生物傳感器應(yīng)能應(yīng)用于力傳導(dǎo)中所涉及的其它蛋白,主要優(yōu)點(diǎn)就是能的分析涉及的機(jī)械力,而且靈敏度高,比一般方法的靈敏度至少高100倍,也能用于檢測(cè)細(xì)胞膜表面變形情況。缺點(diǎn)就是蛋白接觸傳感器會(huì)改變蛋白的功能,因此研究人員需要花費(fèi)較多的時(shí)候嘗試。
在這項(xiàng)研究中,Nakauchi教授采用了一種簡(jiǎn)單的免疫染色技術(shù):?jiǎn)渭?xì)胞磷酸成像分析(single-cell imaging of phosphorylation assay,SCIPhos)。首先將大約50個(gè)細(xì)胞想排列在載玻片上,然后進(jìn)行染色,通過(guò)共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,通過(guò)這些染色了的磷酸化修飾蛋白,Nakauchi教授可以了解哪些蛋白處于活性狀態(tài),哪些蛋白失活了,以及這些蛋白的位置。Nakauchi教授說(shuō),“我的一些學(xué)生也利用這個(gè)方法來(lái)做Western Blotting”。
這種SCIPhos方法的優(yōu)點(diǎn)就是不僅僅能觀察磷酸化蛋白,而且能分析蛋白的位置,這有利于揭示關(guān)鍵的生物信息。缺點(diǎn)就是每個(gè)細(xì)胞需要單個(gè)成像,如果需要處理上千個(gè)細(xì)胞,那就是一個(gè)繁重的實(shí)驗(yàn)了。因此這個(gè)方法比較合適分析少量的細(xì)胞,其中的小技巧就是要多注意防止水分蒸發(fā),Nakauchi教授就是采用的在細(xì)胞液滴的周圍,用阻水筆(water-repellent pen)繞著畫一圈,這樣液滴就不會(huì)干燥得太快。
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