Western Blot(WB)實(shí)驗(yàn)詳解
Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè),對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。我們將通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):
【原理】
與 Southern或Northern雜交方法類(lèi)似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如PVDF膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
【分類(lèi)】
western顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色
現(xiàn)在常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色,目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行,操作也比較簡(jiǎn)單,原理如下(二抗用HRP標(biāo)記):反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發(fā)光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。
【主要試劑】
30%丙烯酰胺混合液,1.5M Tris(pH 8.8),1.0M Tris(pH 6.8),10%SDS,10%過(guò)硫酸銨(APS),N,N,N',N'四甲基二乙胺(TEMED)等。
【主要步驟】
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二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;細(xì)胞因子、信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒、呼吸爆發(fā)試劑盒;動(dòng)植物提取物...
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