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實驗室WB常見問題指南之抗體常見問題

來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2018年04月24日 10:27  

針對抗體常見問題

Q:做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

A:對二抗有無要求,要看你實驗條件來選擇,一般推薦用HRP標記的二抗。

Q:免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?

A:免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構(gòu)象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和 Western,而如果抗體識別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間(限于單抗)。而且一般的說明書上都會寫出用于何種實驗類型,參考說明書即可。

Q:Western Blot 中抗體能重復利用嗎?

A:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內(nèi)使用,4度保存,避免反復凍融。

 

濾紙、膠和膜的問題

Q:NC膜\ PVDF膜\ 尼龍膜有何區(qū)別?

A:尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應用zui廣的一種固相支持物,價格*;PVDF膜介于二者之間。

  • 就結(jié)合能力而言:尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480-600μg/cm2,可結(jié)合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達 80-100μg/cm2,對于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強;PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125-300μg/cm2
  • 就溫度適應性而言:尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA,結(jié)合不牢固;PVDF膜結(jié)合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。
  • 就韌性而言:尼龍膜較強;硝酸纖維素膜較脆,易破碎;PVDF膜較強。
  • 就重復性而言:尼龍膜可反復用于分子雜交,雜交后,探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜不能重復使用;PVDF膜可以重復使用。

Q:做Western Blot時,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?

A:PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。

Q:跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢?是有的成分不對嗎?

A:有可能是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來,在里面加點水保持濕度就可以了。也可能母液(30%聚丙酰胺)有問題,你可以重新配制一份觀察;能夠替換的試劑,盡量換一下,選用好的試劑,避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。

Q: 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,如要分離小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好嗎?

A:這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移,一般建議:21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn),12%SDS-PAGE, 170kd 用7%SDS-PAGE,分開轉(zhuǎn)較好。


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