NGS測(cè)序技術(shù)近年來(lái)得到了巨大發(fā)展，2017年摩根大會(huì)上，Illumina重磅推出NovaSeq測(cè)序儀，NovaSeq可以2天產(chǎn)生2Tb數(shù)據(jù)，通量是10年前Genome Analyzer的2000倍。測(cè)序通量的大幅增加，意味著更多的樣本混合上機(jī)，這樣的話我們?nèi)绾卧诿Ｃ?shù)據(jù)中找到對(duì)應(yīng)樣本匹配的數(shù)據(jù)呢？人們想到了一種在文庫(kù)構(gòu)建時(shí)在接頭上添加“接頭暗號(hào)”的方法，在測(cè)序完成之后根據(jù)“接頭暗號(hào)”對(duì)樣本進(jìn)行分離。這里的接頭暗號(hào)就是樣本標(biāo)簽“Index/Barcode”。本文將以建庫(kù)過(guò)程中要添加的接頭為核心，對(duì)其進(jìn)行全面介紹。

1.接頭是什么？                                                                        

接頭的本質(zhì)是一段短的堿基序列，基本包括三個(gè)部分：與flow-cell上面寡核苷酸相同或互補(bǔ)的片段P5/P7；測(cè)序時(shí)測(cè)序引物結(jié)合部分R1/R2；用于區(qū)分不同樣本的Index。接頭是待測(cè)DNA片段與Flow-cell連接的橋梁，目的片段連接接頭后可以在flow cell上擴(kuò)增再測(cè)序。

 圖1.兩端添加接頭的DNA片段

2.接頭如何分類？                                                                         

接頭的分類方法主要有兩種，一是按照Index的位置，二是按照是否匹配PCR free建庫(kù)。

（1）根據(jù)Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭。單端Index接頭指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），雙端Index接頭指的在P5和P7端均存在Index。（如圖2所示）。Index的數(shù)目直接影響最終上機(jī)能混合的樣本數(shù)目，雙端Index具有比單端Index能容納更多數(shù)目的樣本，近年來(lái)為了滿足一次能測(cè)量更多的樣本的需求，雙端帶Index的接頭被廣泛使用。

圖2：接頭按照Index位置分為單端Index接頭和雙端Index接頭，兩種接頭連接后示意圖

（2）根據(jù)接頭是否匹配PCR free建庫(kù)可以將接頭分為長(zhǎng)接頭和短接頭（見圖3）。長(zhǎng)接頭又稱為完整接頭，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過(guò)TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可不進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接上機(jī)測(cè)序（DNA量足夠上機(jī)測(cè)序時(shí)可直接上機(jī)，當(dāng)DNA量不夠時(shí)還需進(jìn)行PCR擴(kuò)增使得產(chǎn)物達(dá)到一定的量方可上機(jī)測(cè)序）。短接頭通過(guò)TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物就是包含完整接頭的DNA片段（見圖4）。也就是說(shuō)短接頭最終一定要通過(guò)PCR擴(kuò)增成為完整接頭才能上機(jī)測(cè)序。

圖3：左邊為Illumina早期推出的短接頭，不包含Index；右邊為長(zhǎng)接頭，是Illumina目前標(biāo)準(zhǔn)通用接頭樣式

圖4：短接頭建庫(kù)流程圖

3.Index有何奧秘？                                                                   

Index作為接頭中的重要組成部分到底有著怎樣的奧秘呢？簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)Index就是混合樣本中不同樣本的“身份”，其本身就是一段堿基序列，一般長(zhǎng)6nt或8nt。通過(guò)對(duì)這種“身份”的識(shí)別，就可以在混合樣本中對(duì)單個(gè)樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行識(shí)別。那么問(wèn)題來(lái)了，四種堿基隨機(jī)構(gòu)成的排列組合序列那么多，這些都可以用作Index嗎？選擇Index序列的依據(jù)又是什么呢？

Index的選擇需滿足兩個(gè)原則：堿基平衡和激光平衡

a）堿基平衡：是指Index序列的復(fù)雜度和平衡度：復(fù)雜度指的是堿基的種類的多樣；平衡度指的是堿基之間分布比例的均衡。需要注意的是堿基的平衡是指多個(gè)Index之間的平衡，而不是單個(gè)index內(nèi)部的堿基平衡。好的Index序列應(yīng)該是均含有A、T、C、G四種堿基，且各堿基之間的比例接近25%，如圖5所示。

圖5：符合堿基平衡的Index號(hào)（ATGC,TACG,GCTA,CGAT）舉例，分別符合單個(gè)Index內(nèi)部平衡和多個(gè)Index相應(yīng)堿基位的堿基平衡

b）激光平衡：是指在一組Index序列中需滿足每個(gè)堿基位A + C =G + T，在Illumina測(cè)序儀中，A和C兩種堿基共用一種激光，由波長(zhǎng)660nm的紅激光激發(fā)；G和T共用一種激光，由波長(zhǎng)532 nm的綠激光激發(fā)。需要說(shuō)明的是激光平衡是在堿基不平衡的情況下的無(wú)奈之舉，在一定程度上可以提高index測(cè)序時(shí)的堿基識(shí)別質(zhì)量，減少數(shù)據(jù)分離時(shí)出問(wèn)題的可能性，見圖6。

圖6：不符合堿基平衡但符合激光平衡的Index號(hào)（ATGC,TACG,AGAG,TCTC）舉例

如樣本數(shù)為單數(shù)，則必然無(wú)法滿足堿基平衡和激光平衡，此時(shí)可以選擇幾個(gè)縱列是互補(bǔ)的兩個(gè)Index，再加上一個(gè)其他的Index，可保證測(cè)序質(zhì)量。

結(jié)語(yǔ)

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得測(cè)序的通量不斷增加，通量的增加就意味著多樣本混合上機(jī)測(cè)序。由此而來(lái)的問(wèn)題是在NGS的過(guò)程中如何做到對(duì)每個(gè)樣本數(shù)據(jù)的對(duì)號(hào)入座?？茖W(xué)家想到給樣本一個(gè)“身份”，這樣就可以憑證識(shí)別。因此對(duì)于NGS從業(yè)者來(lái)說(shuō)，在享受高通量測(cè)序帶來(lái)的方便快捷的同時(shí)，還要記得給自己的樣本戴好‘證件’哦。